Summary

인간의 면역 세포의 3 차원 시각화를 위한 빛 시트 현미경

Published: June 13, 2018
doi:

Summary

여기, 선물이 빛 시트 현미경을 사용 하 여 3 차원 (3D) 콜라겐 매트릭스에 포함 된 면역 세포를 시각화 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 또한 3d에서 셀 이동 추적 하는 방법 elaborates. 다른 유형의 3D 매트릭스에 현 탁 액 셀이이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

Abstract

Vivo에서, 활성화, 확산, 그리고 모든 면역 세포의 기능 림프절 이나 조직에 예를 들어 3 차원 (3D) 환경에서 발생합니다. 최신, 대부분 체 외에 시스템 셀 문화 또는 coverslips와 같은 2 차원 (2D) 표면에 의존합니다. 최적의 모방 생리 조건에 생체 외에서우리는 간단한 3D 콜라겐 매트릭스를 활용합니다. 콜라겐은 세포 외 기질 (ECM)의 주요 구성 요소 중 하나입니다 그리고 3D 매트릭스 구성에 널리 사용 되 고 있다. 3D 영상에 대 한 최근에 개발한 빛 시트 현미경 기술 (단일 평면 조명 현미경이 라고도 함)는 높은 수집 속도, 큰 침투 깊이, 낮은 표백 및 photocytotoxicity 기능입니다. 또한, 빛 시트 현미경 장기 측정을 위해 특히 유리 하다. 여기 우리는 최적화 된 프로토콜 설정 하 고 인간의 면역 세포, 예를 들어 기본 인간의 세포 독성 T 세포 (CTL)을 처리 하는 방법을 설명 하 고 라이브 셀 이미징에 대 한 빛-시트 현미경과 사용에 대 한 3D 콜라겐 매트릭스에 자연 킬러 (NK) 세포와 고정된 샘플입니다. 이미지 수집 및 세포 이동의 분석을 위한 절차 되 게 됩니다. 특히 초점 중요 한 단계 및 샘플 준비 및 데이터 분석에 대 한 요소를 강조 하기 위해 제공 됩니다. 이 프로토콜은 3D 콜라겐 매트릭스에 현 탁 액 셀의 다른 종류에 대 한 고용 수 있습니다 하 고 면역 세포에 국한 되지 않습니다.

Introduction

마이그레이션에 대 한 대부분 지식 세포에서 온다 2D는 일반적으로 유리 또는 플라스틱 표면 문화/이미징의 실시는1,2,3, 실험 접시. 그러나, 생리 적인 시나리오 필요, 대부분의 경우, 3D microenvironment, 기질 (ECM) 결정적인 역할을 담당 합니다. ECM 뿐만 아니라 적절 한 세포 형태를 유지 하기 위해 3 차원 구조 에센셜을 제공 하지만 또한 생존 신호 또는 많은 셀4,5 의 최적의 기능에 대 한 방향 신호를 제공 합니다. 따라서, 3D 환경이입니다 더 나은 휴대 전화 기능 및 생리 적 컨텍스트를 반영 하는 더 나은 환경에서 동작을 식별 하는 데 필요한.

인간의 신체에서 대부분 세포 면역 세포 특히 3D 시나리오에서 그들의 기능을 발휘 한다. 예를 들어 활성화 된 T 세포 순찰 조직 대상 셀에 대 한 검색, naïve T 세포 마이그레이션 기간 동안 마이그레이션 모드와 기계는 해당 하는 extracellular 적응 그들의 동족 항 원 제시 세포에 대 한 검색에서 림프절을 통해 환경3,,67. 3D 콜라겐 젤 잘 설립 하 고 잘 특징이 3D 셀 문화 시스템8,,910로 널리 사용 되었습니다. 우리의 이전 작품에서는 기본 인간의 세포 높은 모바일 0.25% 콜라겐 기반 매트릭스11약 4.8 µ m/min의 평균 속도에 마이그레이션할. 골격의 재배치는 셀 마이그레이션12에서 핵심 역할을 한다. 세포 이동의 단일 모드에만 적용 되지 않습니다 아직 위치, microenvironment, cytokines, 혈 그라디언트, 특정 마이그레이션 동작 간에 전환할 수 및 extracellular 신호는 조정 보여주는 증거를 축적 된 여러 가지 방법 3에 철새 행동입니다.

안정적으로 면역 세포 기능 및 동작을 예를 들어 마이그레이션, 돌출 형성 또는 기공을 교통 분석을 그것 큰 장점은 신속 하 고 안정적인 방식으로 상대적으로 대용량 3D 이미지를 취득할 수 있을 것입니다. 3D 영상에 대 한 최근에 개발한 빛 시트 현미경 기술 (단일 평면 조명 현미경이 라고도 함)는 만족 스러운 솔루션13,14을 제공 합니다. 이미지 수집, 동안 얇은 정적 빛 시트 샘플을 밝히는 생성 됩니다. 초점 비행기에 이렇게에서 넓은 지역 비행기에서 세포를 영향을 주지 않고 동시에 조명 될 수 있습니다. 이 기능에는 크게 감소 표백 및 photocytotoxicity 높은 수집 속도를 수 있습니다. 이 문서에서 우리 주 인간의 면역 세포 빛 시트 현미경을 사용 하 여 시각화 하는 방법 및 마이그레이션 3D 시나리오에서를 분석 하는 방법을 설명 합니다.

Protocol

인간의 재료 (인간의 혈액 기증자 로부터 백혈구 감소 시스템 실)와 함께이 연구를 위해 실시 하는 연구 승인 지역 윤리 위원회 (16.4.2015 (84/15;에서 선언 교수 박사 Rettig Stürmer))와 해당 지침을 따릅니다. 1. 중화 콜라겐 솔루션의 준비 (500 µ L) 셀 문화 후드 무 균 1.5 mL 튜브에 냉장된 콜라겐 재고 솔루션 (10.4 mg/mL)의 400 µ L를 전송. 천천히의 50 µ L 냉장 10 x PBS (pH 7.0-7.3) 냉?…

Representative Results

T 세포 마이그레이션 중 돌출 형성 걸 의존 하는 매우 역동적인 프로세스입니다. 기본 인간 CTL의 돌출 형성을 시각화 하려면 우리는 뚜렷이11전에 설명한 대로 CTL에 말라 골격을 mEGFP 융합 단백질 페. Transfection, 후에 1 일 셀 콜라겐 매트릭스에 포함 했다. 이미지 스택 인수 했다 모든 40 단계-빛-시트 현미경을 사용 하 여 37 ° C에서 1 µ m의 크기와 함께 s. 같?…

Discussion

대부분 체 외에서 분석 vivo에서 세포, 면역 세포 특히 주로 3D microenvironment을 경험 하는 반면 2D 표면, 세포 배양 배지, 페 트리 접시 또는 coverslips, 예를에 밖으로 수행 됩니다. 증거를 신흥 면역 세포의 이동 패턴 2D 및 3D 시나리오17사이 다 보여줍니다. 또한, 종양 세포의 식을 프로필은 2D 및 3D 교양 조직18,,19<sup class…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리 임상 Hemostaseology 연구소 및 수혈 의학 기증자 혈액;를 제공 하기 위한 감사 합니다. 카르멘 Hässig 및 우수한 기술 지원에 대 한 코 라 호자. 우리 LifeAct mEGFP 구조를 생성 하기 위한 수정된 pMAX 벡터에 대 한 옌스 Rettig (자를란트 대학), 롤랜드 Wedlich-용 병 (뮌스터 대학) 원래 LifeAct-루비 구문 및 기독교 고물 (자를란트 대학) 감사 합니다. 이 프로젝트는 Sonderforschungsbereich 1027 (B.Q. 프로젝트 A2)와 894 (수소 프로젝트 a 1)에 의해 투자 되었다. 빛-시트 현미경 DFG에 의해 투자 되었다 (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).

Materials

Fibricol, bovine collagen solution Advanced Biomatrix  #5133-20ML Collagen matrix
0.5 M NaOH Solution Merck 1091381000 for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agarose Affymetrix 32821-10GM Sample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit Thermo Fisher 11348D Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation Thermo Fisher 11132D Activation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2 Thermo Fisher PHC0023 Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kit Lonza V4XP-30XX Transfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgG Abcam ab124904 IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin Thermo Fisher A22284 IF
CellMask Orange Plasma membrane Stain Thermo Fisher C10045 Fluorescent cell label
Tween 20 Sigma P1379-250mL IF
Triton X-100 Eurobio 018774 IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline Thermo Fisher 14190250 IF
Bovine serum albumin Sigma A9418-100G IF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit Thermo Fisher A-11011 IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) Zeiss N.A.
Cell culture hood Thermo Fisher HeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i  Thermo Fisher N.A.
Centrifuge 5418 and 5452 Eppendorf N.A.
Pippettes Eppendorf 3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tips VWR 89079-444, 89079-436, 89079-452 
15 mL tubes Sarstedt  62.554.002
Capillaries 50 µL VWR (Brand) 613-3373 Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillaries VWR (Brand) BRND701934 "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stips Merck 1095430001 to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringes BD Z230723 ALDRICH Alternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) Play-Doh N.A.
Imaris file converter Bitplane available at http://www.bitplane.com  Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) Bitplane available at http://www.bitplane.com  Analysis of 3D and 4D imaging data

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Citer Cet Article
Schoppmeyer, R., Zhao, R., Hoth, M., Qu, B. Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells. J. Vis. Exp. (136), e57651, doi:10.3791/57651 (2018).

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