Protocol voor het maken van chronische wonden bij diabetische muizen
Summary
Chronische wonden zijn ontwikkeld uit acute wonden op een diabetische muismodel door het induceren van hoge niveaus van oxidatieve stress na een full-dikte cutane wond. De wond wordt behandeld met remmers voor katalase en glutathion peroxidase, resulterend in verminderde genezing en biofilm ontwikkeling door bacteriën aanwezig in de huid microbiome.
Abstract
Chronische wonden ontwikkelen als gevolg van gebrekkige regulering in een of meer complexe cellulaire en moleculaire processen die betrokken zijn bij goede genezing. Ze hebben invloed op ~ 6.5 M mensen en kosten ~ $40B/jaar in de VS alleen. Hoewel een aanzienlijke inspanning is geïnvesteerd in het begrijpen van de ontwikkeling van chronische wonden bij mensen, blijven fundamentele vragen onbeantwoord. Onlangs ontwikkelden we een nieuw muismodel voor diabetische chronische wonden die vele kenmerken van menselijke chronische wonden hebben. Met behulp van db/DB-/- muizen, kunnen we chronische wonden genereren door het induceren van hoge niveaus van oxidatieve stress (OS) in het wond weefsel onmiddellijk na het verwonden, met behulp van een eenmalige behandeling met remmers specifiek voor de antioxidant enzymen katalase en Glutathion peroxidase. Deze wonden hebben een hoge mate van OS, ontwikkelen biofilm natuurlijk, worden volledig chronisch binnen 20 dagen na de behandeling en kunnen meer open blijven voor meer dan 60 dagen. Dit nieuwe model heeft vele kenmerken van diabetische chronische wonden bij de mens en kan daarom aanzienlijk bijdragen tot het bevorderen van fundamenteel begrip van hoe wonden chronisch worden. Dit is een belangrijke doorbraak omdat chronische wonden bij mensen ernstige pijn en leed aan patiënten veroorzaken en resulteren in amputatie als ze niet zijn opgelost. Bovendien zijn deze wonden erg duur en tijdrovend om te behandelen en leiden tot significant verlies van persoonlijk inkomen aan patiënten. Vooruitgang op dit gebied van studie door het gebruik van onze chronische wond model kan de gezondheidszorg voor miljoenen die lijden onder deze slopende aandoening aanzienlijk verbeteren. In dit protocol beschrijven we in detail de procedure om acute wonden te veroorzaken om chronisch te worden, wat nog niet eerder is gedaan.
Introduction
Wondgenezing omvat complexe cellulaire en moleculaire processen die tijdelijk en ruimtelijk gereguleerd zijn, georganiseerd in sequentiële en overlappende stadia waarbij veel verschillende celtypen betrokken zijn, waaronder maar niet beperkt tot de immuunrespons en de vasculaire systeem1. Onmiddellijk nadat de huid een verwonding, factoren en bloedcellen aggregaat op de wond plaats en initiëren van de coagulatie Cascade te vormen een stolsel. Na de homeostase wordt bereikt, de bloedvaten verwijden naar de wond plaats zuurstof, voedingsstoffen, enzymen, antilichamen en Chemotactische factoren die chemotrekken polymorphonucleocytes aan het wond bed van vreemde puin te wissen en afscheiden van Proteolytische enzymen 2. geactiveerde bloedplaatjes scheiden een verscheidenheid van groeifactoren om de keratinocyten aan de wondrand te stimuleren om het gewonde gebied opnieuw te epialiseren. Monocyten die op de wond plaats worden gerekruteerd, differentiëren in macrofagen die fagocytose bacteriën en dode neutrofielen en scheiden extra factoren om keratinocyten proliferatieve en Pro-migratie signalen handhaven. In de proliferatie fase, terwijl re-epithelialisatie blijft, nieuwe granulatieweefsel samengesteld uit fibroblasten, monocyten/macrofagen, lymfocyten, en endotheel cellen blijven het wederopbouwproces2. Angiogenese wordt gestimuleerd door het bevorderen van de proliferatie van endotheliale cellen en migratie, wat resulteert in nieuwe ontwikkeling van het schip. Epithelialisatie en herinrichting van de extracellulaire matrix construeren een barrière tegen het milieu. Naarmate de wond geneest en het granulatieweefsel zich in een litteken ontwikkelt, elimineert apoptosis ontstekingscellen, fibroblasten en endotheel cellen zonder extra weefselbeschadiging te veroorzaken. De treksterkte van het weefsel wordt versterkt door fibroblasten die verschillende componenten van de extracellulaire matrix verbouwen, zoals collageen, zodat het nieuw gevormde weefsel bijna net zo sterk en flexibel is als ongewonde huid2.
Elke afwijking van deze zeer gecoördineerde progressie naar wondsluiting leidt tot verminderde en/of chronische wonden3. Chronische wonden worden gekenmerkt door verhoogde oxidatieve stress, chronische ontsteking, beschadigde Microvasculatuur, en abnormale collageenmatrix in de wond4. Oxidatieve stress, vooral in de wond, kan de wondsluiting2,5vertragen. Wanneer in de eerste fase van de wondgenezing de ontstekings fase ongereguleerd wordt, neemt het gastheer weefsel uitgebreide schade op als gevolg van een continue instroom van ontstekingscellen5 die cytotoxische enzymen vrijgeven, een toename van vrije zuurstof radicalen, en niet-gereglementeerde ontstekingsmediatoren, resulterend in celdood6,7.
In deze destructieve micro omgeving, biofilm-vormende bacteriën profiteren van gastheer voedingsstoffen en dragen bij aan de schade van het gastheer weefsel2. Deze biofilms zijn moeilijk te beheersen en te verwijderen omdat de gehydrateerde extracellulaire polymere stoffen bestaande uit eiwitten, DNA, RNA, en polysacchariden maakt het mogelijk bacteriën verveeld binnen te zijn tolerant voor conventionele antibiotica therapieën en ontwijk de de aangeboren en adaptieve immuunrespons2,8,9van de gastheer.
Het bestuderen van chronische wonden is cruciaal omdat ze invloed hebben op ~ 6.500.000 mensen en kosten ~ $40.000.000.000 per jaar in de VS alleen10. Patiënten met diabetes hebben verhoogde Risico’s voor de ontwikkeling van chronische wonden die amputatie vereisen om de verspreiding van infectie bevatten. Deze patiënten hebben een risico van 50% mortaliteit binnen 5 jaar van amputatie die wordt toegeschreven aan het pathofysiologie mechanisme van diabetes11. De relatie tussen het immuunsysteem van de gastheer en de microbiome in wondgenezing is een belangrijk onderwerp van lopend onderzoek, omdat de gevolgen van chronische wonden, indien onopgelost, amputatie en dood12omvatten.
Hoewel een aanzienlijke inspanning is geïnvesteerd in het begrijpen van hoe chronische wonden zich ontwikkelen bij de mens, het is nog onduidelijk hoe en waarom chronische wonden vorm. Experimenten om de mechanismen van verstoorde genezing te bestuderen is moeilijk te voeren bij mensen, en wond genezings specialisten zien alleen patiënten met chronische wonden die al weken tot maanden een kroniek hebben bereikt. Specialisten zijn dus niet in staat om te bestuderen welke processen er fout gingen waardoor de wond zich zou ontwikkelen tot chronisch2. Er is een gebrek aan diermodellen die de complexiteit van menselijke chronische wonden recapituleren. Tot ons model werd ontwikkeld, bestond er geen model voor chronische wond studies.
Het chronische wond model werd ontwikkeld in muizen die een mutatie hebben in de leptine receptor (db/DB-/-)13. Deze muizen zijn zwaarlijvig, diabetische, en hebben een verstoorde genezing, maar ontwikkelen geen chronische wonden14. Bloedglucose niveaus gemiddeld rond 200 mg/dL, maar kan zo hoog zijn als 400 mg/dL15. Wanneer hoge niveaus van oxidatieve stress (OS) in het wond weefsel onmiddellijk na het verwonden worden geïnduceerd, wordt de wond chronisch16. De db/DB-/- wonden worden beschouwd als chronisch door 20 dagen en blijven open voor 60 dagen of meer. Biofilm geproduceerd door bacteriën kan worden gezien het ontwikkelen van begin drie dagen na het Wounding; een volwassen biofilm kan worden gezien 20 dagen na verwonden en blijft bestaan tot ofwel wondsluiting. De biofilm vormende bacteriën die we vinden in deze muizen zijn ook te vinden in menselijke diabetische chronische wonden.
Oxidatieve stress wordt veroorzaakt door het behandelen van de wonden met twee remmers van antioxidant enzymen, katalase en glutathion peroxidase, twee enzymen met de capaciteit om waterstofperoxide af te breken. Waterstofperoxide is een reactieve zuurstof soort en kan cellulaire schade veroorzaken door de oxidatie van eiwitten, lipiden, en DNA. Catalase katalyseert de afbraak van waterstofperoxide in minder schadelijke chemicaliën zuurstof en water. 3-amino-1, 2, 4-triazol (Atz) remt de katalase door specifiek en covalent binden aan het actieve centrum van het enzym, het inactiveren van17,18,19. Atz is gebruikt om de effecten van oxidatieve stress zowel in vitro als in vivo te bestuderen door de remming van katalase20,21,22,23,24. Glutathion peroxidase katalyseert de reductie van waterstofperoxide door de antioxidant, glutathion, en is een belangrijk enzym dat de cel beschermt tegen oxidatieve stress25. Mercaptosuccininezuur (MSA) remt glutathion peroxidase door binding met de selenocysteïne actieve plaats van het enzym met thiol, het inactiveren26. MSA is gebruikt om de effecten van oxidatieve stress in vitro en in vivo ook20,27,28te bestuderen.
Dit nieuwe model van chronische wonden is een krachtig model om te bestuderen, omdat het veel van dezelfde kenmerken deelt die zijn waargenomen bij chronische wonden bij menselijke diabetische, waaronder langdurige ontsteking van verhoogde OS en natuurlijke biofilm vorming van huid-microbiome. De wonden hebben een verminderde dermale-epidermale interactie, abnormale matrix depositie, slechte angiogenese en beschadigde vasculatuur. Chronische wonden zullen zich ontwikkelen in zowel mannelijke als vrouwelijke muizen, zodat beide geslachten kunnen worden gebruikt om chronische wonden te bestuderen. Daarom kan het chronische wond model aanzienlijk bijdragen tot een fundamenteel begrip van hoe dergelijke wonden beginnen. Het gebruik van dit chronische wond model kan antwoorden bieden op fundamentele vragen over hoe de chroniteit wordt geïnitieerd/bereikt door middel van bijdragen uit de Fysiologie van verstoorde wondgenezing en het microbiome van de gastheer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zodra er chronische wonden zijn ontstaan op de muizen, kan het model worden gebruikt om een verstoorde wond genezingsprocessen te bestuderen die betrokken zijn bij de inleiding van de kroning. Het model kan ook worden gebruikt voor het testen van de werkzaamheid van een breed scala van chemicaliën en geneesmiddelen die chronische wond ontwikkeling en verstoorde genezing kunnen omkeren en leiden tot wondsluiting en genezing. Verschillende tijdpunten na het begin van de kronings periode kunnen worden bestudeerd: bijvo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs hebben geen erkenningen.
Materials
| B6.BKS(D)-Leprdb/J | The Jackson Laboratory | 00697 | Homozygotes and heterozygotes available |
| Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin | Nair | a chemical depilatory | |
| Buprenex (buprenorphine HCl) | Henry Stein Animal Health | 059122 | 0.3 mg/ml, Class 3 |
| 3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) | TCI | A0432 | |
| Mercaptosuccinic acid (MSA) | Aldrich | 88460 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | autoclave steriled | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
| Oxygen | Tank must be compatible with vaporizing system | ||
| Isoflurane vaporizer | JA Baulch & Associates | ||
| Wahl hair clipper | Wahl | Lithium Ion Pro | |
| Acu Punch 7mm skin biopsy punches | Acuderm Inc. | P750 | |
| Tegaderm | 3M | Ref: 1624W | Transparent film dressing (6 cm x 7 cm) |
| Heating pad | Conair | Moist Dry Heating Pad | |
| Insulin syringes | BD | 329461 | 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2") |
| 70% ethanol | |||
| Kimwipes | |||
| Tweezers | |||
| Sharp surgical scissors | |||
| Thin metal spatula | |||
| Tubing | |||
| Mouse nose cone | |||
| Gloves | |||
| small plastic containers |
References
- Singer, A. J., Clark, R. A. F. Cutaneous wound healing. New England Journal of Medicine. 341 (10), 738-746 (1999).
- Nouvong, A., Ambrus, A. M., Zhang, E. R., Hultman, L., Coller, H. A. Reactive oxygen species and bacterial biofilms in diabetic wound healing. Physiological Genomics. 48 (12), 889-896 (2016).
- MacLeod, A. S., Mansbridge, J. N. The innate immune system in acute and chronic wounds. Advanced Wound Care. 5 (2), 65-78 (2016).
- Zhao, G., et al. Biofilms and Inflammation in Chronic Wounds. Advanced Wound Care. 2 (7), 389-399 (2013).
- Wlaschek, M., Scharffetter-Kochanek, K. Oxidative stress in chronic venous leg ulcers. Wound Repair and Regeneration. 13 (5), 452-461 (2005).
- Stadelmann, W. K., Digenis, A. G., Tobin, G. R. Physiology and healing dynamics of chronic cutaneous wounds. American Journal of Surgery. 176 (2), 26-38 (1998).
- Loots, M. A., Lamme, E. N., Zeegelaar, J., Mekkes, J. R., Bos, J. D., Middelkoop, E. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. Journal of Investigative Dermatology. 111 (5), 850-857 (1998).
- Costerton, W., Veeh, R., Shirtliff, M., Pasmore, M., Post, C., Ehrlich, G. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. Journal of Clinical Investigation. 112 (10), 1466-1477 (2003).
- Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Armstrong, D. G., Wrobel, J., Robbins, J. M. Are diabetes-related wounds and amputations worse than cancer. International Wound Journal. 4 (4), 286-287 (2007).
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 37-44 (2008).
- Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: Identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
- Coleman, D. L. Obese and diabetes: Two mutant genes causing diabetes-obesity syndromes in mice. Diabetologia. 14 (3), 141-148 (1978).
- Garris, D. R., Garris, B. L. Genomic modulation of diabetes (db/db) and obese (ob/ob) mutation-induced hypercytolipidemia: cytochemical basis of female reproductive tract involution. Cell Tissue Research. 316 (2), 233-241 (2014).
- Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. Journal of Diabetes Research. , (2014).
- Feinstein, R. N., Berliner, S., Green, F. O. Mechanism of inhibition of catalase by 3-amino-1,2,4-triazole. Archives of Biochemistry and Biophysics. 76 (1), 32-44 (1958).
- Margoliash, E., Novogrodsky, A. A study of the inhibition of catalase by 3-amino-1:2:4:-triazole. Biochemical Journal. 68 (3), 468-475 (1958).
- Margoliash, E., Novogrodsky, A., Schejter, A. Irreversible reaction of 3-amino-1:2:4-triazole and related inhibitors with the protein of catalase. Biochemical Journal. 74 (2), 339-348 (1960).
- Shiba, D., Shimamoto, N. Attenuation of endogenous oxidative stress-induced cell death by cytochrome P450 inhibitors in primary cultures of rat hepatocytes. Free Radical Biology and Medicine. 27 (9-10), 1019-1026 (1999).
- Ishihara, Y., Shimamoto, N. Critical role of exposure time to endogenous oxidative stress in hepatocyte apoptosis. Redox Report. 12 (6), 275-281 (2007).
- Valenti, V. E., de Abreu, L. C., Sato, M. A., Ferreira, C. ATZ (3-amino-1,2,4-triazole) injected into the fourth cerebral ventricle influences the Bezold-Jarisch reflex in conscious rats. Clinics. 65 (12), 1339-1343 (2010).
- Welker, A. F., Campos, E. G., Cardoso, L. A., Hermes-Lima, M. Role of catalase on the hypoxia/reoxygenation stress in the hypoxia-tolerant Nile tilapia. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1111-1118 (2012).
- Bagnyukova, T. V., Vasylkiv, O. Y., Storey, K. B., Lushchak, V. I. Catalase inhibition by amino triazole induces oxidative stress in goldfish brain. Brain Research. 1052 (2), 180-186 (2005).
- Falck, E., Karlsson, S., Carlsson, J., Helenius, G., Karlsson, M., Klinga-Levan, K. Loss of glutathione peroxidase 3 expression is correlated with epigenetic mechanisms in endometrial adenocarcinoma. Cancer Cell International. 10 (46), (2010).
- Chaudiere, J., Wilhelmsen, E. C., Tappel, A. L. Mechanism of selenium-glutathione peroxidase and its inhibition by mercaptocarboxylic acids and other mercaptans. Journal of Biological Chemistry. 259 (2), 1043-1050 (1984).
- Dunning, S., et al. Glutathione and antioxidant enzymes serve complementary roles in protecting activated hepatic stellate cells against hydrogen peroxide-induced cell death. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (12), 2027-2034 (2013).
- Franco, J. L., et al. Methylmercury neurotoxicity is associated with inhibition of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase. Free Radical Biology and Medicine. 47 (4), 449-457 (2009).
- Sundberg, J. P., Silva, K. A. What color is the skin of a mouse. Veterinary Pathology. 49 (1), 142-145 (2012).
- Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging & Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
- Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nature Protocols Exchange. , (2016).
- Aasum, E., Hafstad, A. D., Severson, D. L., Larsen, T. S. Age-dependent changes in metabolism, contractile function, and ischemic sensitivity in hearts from db/db mice. Diabetes. 52 (2), 434-441 (2003).
- Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 52-60 (2001).
- Janssen, B. J., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).
- Osborn, O., et al. Metabolic characterization of a mouse deficient in all known leptin receptor isoforms. Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (1), 23 (2010).
- Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
- Gjødsbøl, K., et al. No need for biopsies: Comparison of three sample techniques for wound microbiota determination. International Wound Journal. 9 (3), 295-302 (2012).
- Wolcott, R. D., et al. Analysis of the chronic wound microbiota of 2,963 patients by 16S rDNA pyrosequencing. Wound Repair Regeneration. 24 (1), 163-174 (2016).
- Gjødsbøl, K., Christensen, J. J., Karlsmark, T., Jørgensen, B., Klein, B. M., Krogfelt, K. A. Multiple bacterial species reside in chronic wounds: a longitudinal study. International Wound Journal. 3 (3), 225-231 (2006).
- Dowd, S. E., et al. Survey of bacterial diversity in chronic wounds using Pyrosequencing, DGGE, and full ribosome shotgun sequencing. BMC Microbiology. 8 (43), (2008).
- Price, L. B., et al. Community analysis of chronic wound bacteria using 16S rrna gene-based pyrosequencing: Impact of diabetes and antibiotics on chronic wound microbiota. PLoS One. 4 (7), 6462 (2009).
- Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
- Dowd, S. E., et al. Polymicrobial nature of chronic diabetic foot ulcer biofilm infections determined using bacterial tag encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP). PLoS One. 3 (10), 3326 (2008).
- Price, L. B., et al. Macroscale spatial variation in chronic wound microbiota: A cross-sectional study. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 80-88 (2011).
- Gontcharova, V., Youn, E., Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Comparison of bacterial composition in diabetic ulcers and contralateral intact skin. Open Microbiology Journal. 4, 8-19 (2010).
- Smith, K., et al. One step closer to understanding the role of bacteria in diabetic foot ulcers: characterising the microbiome of ulcers. BMC Microbiologyogy. 16 (54), (2016).
- Gardner, S. E., Hillis, S. L., Heilmann, K., Segre, J. A., Grice, E. A. The Neuropathic diabetic foot ulcer microbiome is associated with clinical factors. Diabetes. 62 (3), 923-930 (2013).
- Loesche, M., et al. Temporal stability in chronic wound microbiota is associated with poor healing. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 237-244 (2017).
- Kalan, L., et al. Redefining the chronic-wound microbiome: Fungal communities are prevalent, dynamic, and associated with delayed healing. MBio. 7 (5), 01058-01116 (2016).
- Blakytny, R., Jude, E. The molecular biology of chronic wounds and delayed healing in diabetes. Diabetic Medicine. 23 (6), 594-608 (2006).
