Protocollo per creare ferite croniche nei topi diabetici
Summary
Le ferite croniche sono sviluppate da ferite acute su un modello di topo diabetico inducendo alti livelli di stress ossidativo dopo una ferita cutanea a tutto spessore. La ferita viene trattata con inibitori per catalasi e glutathione peroxidasi, con conseguente alterazione della guarigione e sviluppo di biofilm da parte di batteri presenti nel microbioma cutaneo.
Abstract
Le ferite croniche si sviluppano a seguito di una regolazione difettosa in uno o più processi cellulari e molecolari complessi coinvolti in una corretta guarigione. Hanno un impatto sulle persone di 6,5 milioni di dollari e costano 40 miliardi di dollari all’anno solo negli Stati Uniti. Anche se è stato investito uno sforzo significativo per capire come si sviluppano le ferite croniche negli esseri umani, le domande fondamentali rimangono senza risposta. Recentemente, abbiamo sviluppato un nuovo modello murino per le ferite croniche diabetiche che hanno molte caratteristiche delle ferite croniche umane. Utilizzando topi db/db-/-, possiamo generare ferite croniche inducendo alti livelli di stress ossidativo (OS) nel tessuto della ferita immediatamente dopo la ferita, utilizzando un trattamento una tantum con inibitori specifici per gli enzimi antiossidanti catalasi e perossidasi glutathione. Queste ferite hanno alti livelli di OS, sviluppano biofilm naturalmente, diventano completamente croniche entro 20 giorni dal trattamento e possono rimanere aperte per più di 60 giorni. Questo nuovo modello ha molte caratteristiche delle ferite croniche diabetiche negli esseri umani e quindi può contribuire in modo significativo ad far progredire la comprensione fondamentale di come le ferite diventano croniche. Questo è un importante passo avanti perché le ferite croniche negli esseri umani causano dolore significativo e angoscia ai pazienti e provocano l’amputazione se irrisolto. Inoltre, queste ferite sono molto costose e dispendiose in termini di tempo per il trattamento e portano a una significativa perdita di reddito personale per i pazienti. I progressi in questo campo di studio attraverso l’uso del nostro modello di ferita cronica possono migliorare significativamente l’assistenza sanitaria per milioni di persone che soffrono in questa condizione debilitante. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio la procedura per far sì che le ferite acute diventino croniche, cosa che non è mai stata fatta prima.
Introduction
La guarigione delle ferite comporta complessi processi cellulari e molecolari regolati temporalmente e spazialmente, organizzati in fasi sequenziali e sovrapposte che coinvolgono molti tipi di cellule diverse, tra cui, ma non solo, alla risposta immunitaria e alla vascolare sistema1. Immediatamente dopo che la pelle subisce una lesione, fattori e cellule del sangue si aggregano al sito della ferita e avviano la cascata di coagulazione per formare un coagulo. Dopo l’omeostasi raggiunta, i vasi sanguigni si dilatano per far entrare nel sito della ferita ossigeno, sostanze nutritiche, enzimi, anticorpi e fattori chemiotattici che chemoattrale polimorfonucleociti per eliminare il letto della ferita da detriti estranei e enzimi proteolitici secerneri 2. Le piastrine attivate secernono una varietà di fattori di crescita per stimolare i cheratinociti sul bordo della ferita per epitecarizzare nuovamente l’area ferita. I monociti reclutati nel sito della ferita si differenziano in macrofagi che fagocitosi batteri e neutrofili morti e secernono ulteriori fattori per mantenere i segnali cheratinociti proliferanti e pro-migranti. Nella fase di proliferazione, mentre la riepitelializzazione continua, nuovo tessuto di granulazione composto da fibroblasti, monociti/macrofagi, linfociti e cellule endoteliali continua il processo di ricostruzione2. L’angiogenesi viene stimolata promuovendo la proliferazione e la migrazione delle cellule endoteliali, con conseguente sviluppo di nuovi vasi. L’epitelizzazione e il rimodellamento della matrice extracellulare costruiscono una barriera contro l’ambiente. Come la ferita guarisce e tessuto di granulazione si evolve in una cicatrice, l’apoptosi elimina le cellule infiammatorie, fibroblasti, e le cellule endoteliali senza causare ulteriori danni ai tessuti. La resistenza alla tensione del tessuto è esaltata dai fibroblasti che rimodellano vari componenti della matrice extracellulare, come il collagene, in modo che il tessuto appena formato sia quasi forte e flessibile come la pelle non leato2.
Qualsiasi deviazione da questa progressione altamente concertata verso la chiusura delle ferite porta a ferite alterate e/o croniche3. Le ferite croniche sono caratterizzate da un aumento dello stress ossidativo, infiammazione cronica, microvascolatura danneggiata e matrice anormale del collagene nella ferita4. Lo stress ossidativo, soprattutto nella ferita, può ritardare la chiusura della ferita2,5. Quando, nella prima fase di guarigione delle ferite, la fase infiammatoria diventa non regolamentata, il tessuto ospite assume danni estesi a causa di un afflusso continuo di cellule infiammatorie5 che rilasciano enzimi citotossici, un aumento dei radicali liberi di ossigeno, e mediatori infiammatori non regolamentati, con conseguente morte cellulare6,7.
In questo microambiente distruttivo, i batteri che formano biofilm sfruttano i nutrienti dell’ospite e contribuiscono al danno del tessuto ospite2. Questi biofilm sono difficili da controllare e rimuovere perché le sostanze polimeriche extracellulari idratate composte da proteine, DNA, RNA e polisaccaridi consentono ai batteri ospitati all’interno di essere tolleranti alle terapie antibiotiche convenzionali ed eludere il risposta immunitaria innata e adattativa dell’ospite2,8,9.
Studiare le ferite croniche è fondamentale perché hanno un impatto su 6,5 milioni di dollari di persone ed costano 40 miliardi di dollari all’anno solo negli Stati Uniti10. I pazienti con diabete hanno aumentato i rischi per lo sviluppo di ferite croniche che richiedono amputazioni per contenere la diffusione dell’infezione. Questi pazienti hanno un rischio di mortalità del 50% entro 5 anni dall’amputazione attribuita al meccanismo di fisiopatologia del diabete11. La relazione tra il sistema immunitario dell’ospite e il microbioma nella guarigione delle ferite è un argomento vitale della ricerca in corso perché le conseguenze delle ferite croniche, se irrisolte, includono l’amputazione e la morte12.
Anche se uno sforzo significativo è stato investito nella comprensione di come si sviluppano le ferite croniche negli esseri umani, non è ancora chiaro come e perché si formano le ferite croniche. Gli esperimenti per studiare i meccanismi di guarigione alterata sono difficili da condurre negli esseri umani, e gli specialisti di guarigione delle ferite vedono solo i pazienti con ferite croniche che hanno già raggiunto la cronicità per settimane o mesi. Così, gli specialisti non sono in grado di studiare quali processi sono andati male che portano la ferita a svilupparsi per diventare cronica2. Mancano modelli animali che riassumono la complessità delle ferite croniche umane. Fino a quando non è stato sviluppato il nostro modello, non esisteva alcun modello per gli studi sulle ferite croniche.
Il modello della ferita cronica è stato sviluppato nei topi che hanno una mutazione nel recettore della leptina (db/db-/-)13. Questi topi sono obesi, diabetici e hanno problemi di guarigione ma non sviluppano ferite croniche14. Livelli di glucosio nel sangue media intorno 200 mg/dL, ma può essere alto come 400 mg/dL15. Quando alti livelli di stress ossidativo (OS) nel tessuto della ferita vengono indotti immediatamente dopo la ferita, la ferita diventa cronica16. Le ferite db/db-/- sono considerate croniche entro 20 giorni e rimangono aperte per 60 giorni o più. I biofilm prodotti dai batteri possono essere visti in via di sviluppo a partire da tre giorni dopo la ferita; un biofilm maturo può essere visto 20 giorni dopo il ferimento e persiste fino alla chiusura della ferita. I batteri che formano i biofilm che troviamo in questi topi si trovano anche nelle ferite croniche diabetiche umane.
Lo stress ossidativo è indotto dal trattamento delle ferite con due inibitori di enzimi antiossidanti, catalasi e glutathione perossidasi, due enzimi con la capacità di abbattere il perossido di idrogeno. Il perossido di idrogeno è una specie reattiva di ossigeno e può causare danni cellulari attraverso l’ossidazione di proteine, lipidi e DNA. Catalase catalizza la decomposizione del perossido di idrogeno in ossigeno e acqua chimici meno nocivi. 3-Amino-1,2,4-triazole (TT) inibisce la catalasi legando specificamente e covalentmente al centro attivo dell’enzima, inattivandolo17,18,19. L’ATA è stato utilizzato per studiare gli effetti dello stress ossidativo sia in vitro che in vivo attraverso l’inibizione della catalise20,21,22,23,24. Glutathione perossidase catalizza la riduzione del perossido di idrogeno attraverso l’antiossidante, glutathione, ed è un enzima importante che protegge la cellula contro lo stress ossidativo25. L’acido mercaptosuccinico (MSA) inibisce la glutathione peroxidasi legandosi al sito attivo selenocisteine dell’enzima con tiol, inattivandolo26. MSA è stato utilizzato per studiare gli effetti dello stress ossidativo in vitro e in vivo così come20,27,28.
Questo nuovo modello di ferite croniche è un modello potente da studiare perché condivide molte delle stesse caratteristiche osservate nelle ferite croniche diabetiche umane, tra cui l’infiammazione prolungata da un aumento del sistema operativo e la formazione di biofilm naturale dal microbioma cutaneo. Le ferite hanno alterate l’interazione dermicaia, deposizione anomala di matrice, scarsa angiogenesi e vascolatura danneggiata. Le ferite croniche si svilupperanno sia nei topi maschi che in quella femminile, quindi entrambi i sessi possono essere utilizzati per studiare le ferite croniche. Pertanto, il modello di ferita cronica può contribuire in modo significativo a far progredire la comprensione fondamentale di come iniziano tali ferite. L’utilizzo di questo modello di ferita cronica può fornire risposte a domande fondamentali su come la cronicità viene iniziata / ottenuta attraverso i contributi della fisiologia della guarigione alterata delle ferite e del microbioma dell’ospite.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una volta che le ferite croniche vengono create sui topi, il modello può essere utilizzato per studiare i processi di guarigione delle ferite alterate coinvolti nell’avvio della cronicità. Il modello può anche essere utilizzato per testare l’efficacia di una vasta gamma di sostanze chimiche e farmaci che possono invertire lo sviluppo cronico delle ferite e la guarigione compromessa e portare alla chiusura e alla guarigione delle ferite. È possibile studiare diversi punti temporali dopo l’inizio della cronicità: …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori non hanno riconoscimenti.
Materials
| B6.BKS(D)-Leprdb/J | The Jackson Laboratory | 00697 | Homozygotes and heterozygotes available |
| Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin | Nair | a chemical depilatory | |
| Buprenex (buprenorphine HCl) | Henry Stein Animal Health | 059122 | 0.3 mg/ml, Class 3 |
| 3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) | TCI | A0432 | |
| Mercaptosuccinic acid (MSA) | Aldrich | 88460 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | autoclave steriled | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
| Oxygen | Tank must be compatible with vaporizing system | ||
| Isoflurane vaporizer | JA Baulch & Associates | ||
| Wahl hair clipper | Wahl | Lithium Ion Pro | |
| Acu Punch 7mm skin biopsy punches | Acuderm Inc. | P750 | |
| Tegaderm | 3M | Ref: 1624W | Transparent film dressing (6 cm x 7 cm) |
| Heating pad | Conair | Moist Dry Heating Pad | |
| Insulin syringes | BD | 329461 | 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2") |
| 70% ethanol | |||
| Kimwipes | |||
| Tweezers | |||
| Sharp surgical scissors | |||
| Thin metal spatula | |||
| Tubing | |||
| Mouse nose cone | |||
| Gloves | |||
| small plastic containers |
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