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Article de méthode

Intracrânienne subarachnoïdien voie d’Infection pour enquêter sur les rôles des Biofilms de Streptococcus suis en méningite dans un modèle d’Infection de souris

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DOI :

10.3791/57658

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1 juillet 2018

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1College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, 2Key Lab of Animal Bacteriology, Ministry of Agriculture, 3OIE Reference Lab for Swine Streptococcosis, 4School of Medicine, Tsinghua University, 5Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici la voie intracrânienne subarachnoïdien d’infection chez les souris pour étudier les rôles des biofilms dans Streptococcus suis méningite. Ce modèle d’infection est également adapté pour l’étude de la pathogenèse de l’autre une méningite bactérienne et l’efficacité des nouveaux médicaments contre la méningite bactérienne.

Résumé

Streptococcus suis est non seulement un bactérie pathogène majeur de porcs dans le monde entier, mais aussi un agent zoonotique émergent. Chez les humains et les porcs, la méningite est une manifestation importante des infections à S. suis . Un modèle adapté de l’infection est un outil essentiel pour comprendre les mécanismes des maladies causées par des pathogènes. Plusieurs voies d’infection chez les souris ont été développés pour étudier la pathogenèse de l’infection à S. suis . Cependant, les voies intrapéritonéales, par voie nasale et par voie intraveineuse d’infection ne conviennent pas pour étudier les rôles des composantes de la surface S. suis méningite directement dans le cerveau, comme la matrice extracellulaire de biofilms. Bien que l’inoculation intracisternale a été utilisée pour infection à S. suis , le site d’injection précise n’a pas été décrit. Ici, la voie intracrânienne subarachnoïdien d’infection a été décrite dans un modèle murin d’enquêter sur le rôle des biofilms dans S. suis méningite. S. suis cellules planctoniques ou biofilm État cellules ont été injectées directement dans l’espace sous-arachnoïdien de souris par le biais du site d’injection situé rostrale de la bregma 3,5 mm. Analyse histopathologique et une expression de l’ARNm de TLR2 et cytokines des tissus cérébraux de souris injectées avec des cellules d’État biofilm a clairement indiquent que S. suis biofilm joue un rôle définitif dans S. suis méningite. Cette voie d’infection présente des avantages évidents sur les autres voies d’infection, ce qui permet l’étude de l’interaction hôte-bactérie. En outre, il permet l’effet des composantes bactériennes sur les réponses immunitaires hôte directement dans le cerveau pour être évalués et imite l’entrée bactérienne dans le système nerveux central. Cette voie d’infection peut être étendue pour étudier les mécanismes de la méningite causée par d’autres bactéries. En outre, il peut également être utilisé pour tester l’efficacité des médicaments contre la méningite bactérienne.

Introduction

Streptococcus suis (S. suis) est un bactérie pathogène majeur de porcs dans le monde, provoquant des maladies graves, y compris la méningite, pneumonie, septicémie, endocardite et arthrite1. C’est aussi un agent zoonotique émergent. Jusqu’ici, on a signalé que les neuf sérotypes peuvent provoquer une infection chez l’homme, y compris les sérotypes 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 et 312,3,4. Chez les humains et les porcs, la méningite est l’un des principaux signes cliniques des infections à S. suis . Au Vietnam et en Thaïlande, S. suis est la principale cause de méningite chez les adultes,5. Biofilms microbiens sont des micro-organismes qui adhèrent les uns aux autres et sont concentrent à l’interface. ils sont essentiels pour la virulence bactérienne, la survie dans des environnements variés et5de la résistance aux antibiotiques. Biofilms sont généralement entourés d’une matrice extracellulaire qui généralement contient des polysaccharides, protéines et ADN6. Ce dernier est capable de susciter des réactions inflammatoires de l’hôte et cytokine production7. La formation de biofilm a signalé de participer à streptocoque méningite lors d’études antérieures. Biofilms contribuent à Streptococcus agalactiae méningite dans un modèle de poisson tilapia et la formation de biofilm a été révélée dans les tissus du cerveau et autour méningée surfaces in vivo par inoculation intra-abdominale8. Au cours de la méningite, Streptococcus pneumoniae est dans un état semblable au biofilm et de bactéries dans un tel état de biofilm ont été plus efficaces dans l’induction de méningite chez une souris infection modèle9. En outre, dans notre précédente étude, l’état de biofilm associé de S. suis dans le cerveau de souris contribue à la virulence bactérienne en analyse de survie10. Toutefois, une preuve directe pour implication de biofilm dans S. suis méningite exige davantage enquête.

Des modèles animaux de l’infection à S. suis ont été développés chez les souris en utilisant la voie intrapéritonéale11, par voie nasale (i.n.)12, par voie intraveineuse (i.v.)13et les routes intracisternale (i.c.) d’infection14, 15 , 16. Toutefois, les itinéraires i.p., i.n. et i.v. d’infection ne conviennent pas pour étudier les rôles des composantes de la surface S. suis méningite directement dans le cerveau. Il s’agit d’une matrice extracellulaire de biofilms. Bien que l’inoculation i.c. a été utilisée pour infection à S. suis , le site d’injection précise n’a pas été décrit dans ces documents. En revanche, les coordonnées stéréotaxiques du site d’injection pour l’inoculation intracrânienne subarachnoïdien a clairement été décrit dans une précédente étude17. Cela a permis de reconnaissance simple du point d’inoculation et plan expérimental plus simpliste. En outre, la voie intracrânienne subarachnoïdien d’infection imite entrée bactérienne dans le système nerveux central du sinus ou l' oreille moyenne17et la relation entre l’oreille moyenne et la méningite causée par S. suis a été démontrée par Madsen et al.18. En outre, en appliquant la voie intracrânienne subarachnoïdien d’infection chez la souris, nous avons démontré que S. suis petit RNA rss04 contribue à la méningite dans notre précédente étude10.

Dans la présente étude, la voie intracrânienne subarachnoïdien d’infection a été utilisée chez les souris pour étudier les rôles des biofilms dans S. suis méningite. Souris ont été infectées avec des cellules planctoniques ou de biofilms de cellules état de S. suis par cette voie d’infection. Analyse histopathologique et expression de l’ARNm accrue de TLR2 et cytokines du tissu de cerveau de souris injectées avec des cellules d’État biofilm a clairement indiquent que S. suis biofilm contribue à la méningite.

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Protocole

Les expériences d’infection de souris ont été approuvés par le laboratoire Animal surveillance Comité de Province de Jiangsu, Chine et effectuées dans le laboratoire Animal Center of Nanjing Agricultural University (numéro de permis : SYXK (Su) 2017-0007).

1. préparation de bactéries

Remarque : S. suis souche virulente de sérotype 2 P1/7 a été isolée provenant d’un porc malade avec méningite19. Souche P1/7 a été cultivé dans le bouillon de Todd-Hewitt (THB, formule par litre de THB : Infusion de cœur, 3,1 g néopeptone, 20,0 g dextrose, 2,0 g ; Chlorure de sodium, 2,0 g ; phosphate disodique, 0,4 g ;, 2,5 g de carbonate de sodium) et plaqué sur gélose de Todd-Hewitt (THA, formule par litre de THA : Infusion de cœur, 3,1 g ; néopeptone, 20,0 g ; dextrose, 2,0 g ; chlorure de sodium, 2,0 g ; phosphate disodique, 0,4 g ; carbonate de sodium, 2,5 g ; agar, 15,0 g) à 37 ° C et 5 % de CO2.

  1. Collection de souche P1/7 cellules planctoniques
    1. Collecter les 5 mL de cellules planctoniques de culture en phase logarithmique (OD600= 0,6), centrifuger pendant 3 min à 8000 × g et puis laver 3 fois avec du PBS.
    2. Remettre en suspension les cellules avec 5 mL de 25 % de glycérol en THB, aliquote dans des tubes de 5 et ensuite le stocker à-80 ° C.
  2. Collection de souche de cellules d’état de biofilm P1/7
    1. Prélever 20 mL d’une culture d’une nuit ou plus et ajouter à 180 mL de THB fraîche ; Répartissez la culture diluée dans 10 plaques de culture ronde également, puis mettre les plaques dans un incubateur à 37 ° C à 5 % de CO2 pendant 24 h.
    2. Après incubation, secouer la plaque doucement pour remettre en suspension les bactéries qui n’ont pas adhéré à la plaque et puis jeter le surnageant par aspiration.
      NOTE : Secouez la plaque et éviter resuspendant les sédiments.
    3. Ajouter 5 mL de PBS de récolter les cellules État biofilm, remettre en suspension les sédiments complètement et puis transférer l’échantillon dans un nouveau tube.
    4. Laisser agir les biofilms de cellules d’état de la dernière étape avec les paramètres suivants : 60 W, 4 cycles, 5 s sur et 10 s éteint.
    5. Centrifuger pendant 3 min à 8000 × g et stocker le liquide surnageant à-80 ° C.
      NOTE : Le surnageant peut contenir des composants de biofilm et il peut être utilisé pour remettre en suspension les bactéries biofilm avant l’infection comme décrit dans l’expérimentation animale (étape 3).
    6. Remettre en suspension les sédiments avec 10 mL 25 % de glycérol en THB et puis stockez les biofilms de cellules d’État à-80 ° C.

2. analyse analyse de microscopie électronique (SEM)

  1. Fixer les cellules État biofilm recueillies et les cellules planctoniques à l’aide de paraformaldéhyde à 4 % pour les 12 à 24 heures à 4 ° C.
  2. Rincez les échantillons rapidement avec de l’eau distillée et déshydrater les échantillons dans l’ordre avec une concentration croissante d’éthanol (25 %, 50 %, 70 %, 90 % et 100 %) pendant 30 min dans chaque solution.
  3. Respecter les échantillons séchés titulaires avec du ruban adhésif double-face en métal et enfin de les enrober dans un évaporateur d’or et de palladium.
  4. Observer les échantillons par un microscope électronique à balayage utilisant les paramètres suivants : ISE (Extra haute Tension) = 10 kV ; WD (Distance de travail) = 7.0 ou 8.0 mm ; Grossissement = 5000 × ; A du signal = SE1.

3. animal Experiments

  1. Utiliser SPF 6 semaines des souris femelles BALB/c dans cette étude. Infecter toutes les souris par voie intracrânienne subarachnoïdien d’infection dont point d’injection se trouve à 3,5 mm rostrale de la bregma. Les coordonnées stéréotaxiques du site d’injection ont été clairement décrits par Chiavolini et al.17.
    1. Pour une analyse histopathologique, infecter les deux groupes de souris (5 souris par groupe) à l’aide de cellules planctoniques ou biofilm état de cellules à une dose de 3 × 107 unités formant colonie (UFC), et un autre 5 souris ont été injectés avec du PBS comme un contrôle.
    2. Pour infecter de détection de l’expression de l’ARNm de TLR2 et cytokines dans le cerveau, deux groupes supplémentaires de souris (6 souris par groupe) à l’aide de cellules planctoniques ou biofilm état les cellules à une dose de 3 × 107 UFC.
    3. Déterminer le nombre de bactéries viables en ensemençant des dilutions en série sur THA.
    4. Euthanasier toutes les souris à infection après 12 h de poursuivre les recherches.
      Remarque : Le glycérol dans le milieu de stock doit être supprimée avant l’infection. Les cellules d’état de biofilm récupérés de-80 ° C et les cellules planctoniques sont lavés 3 fois avec du PBS. Puis, les cellules planctoniques sont remises en suspension avec du PBS et diluées à la dose appropriée pour l’infection ; biofilm État cellules sont remises en suspension avec le surnageant stocké (de l’étape 1.2.5) et dilués à la dose appropriée pour l’infection. Le volume d’infection ne devrait pas être plus de 50 µL.
  2. Détection de l’expression de l’ARNm de TLR2 et cytokines dans le tissu cérébral
    1. Extraire l’ARN total de tissus du cerveau à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN.
      1. Pour chaque souris, utiliser le tissu de cerveau entier permettant d’extraire des RNA. Diviser le tissu de cerveau entier en 5 tubes. Prendre aux tissus du cerveau 100 mg et ajouter 1 mL de solution de lyse dans chaque tube contenant la matrice lyse fournie par le kit.
      2. Traiter le tube dans un homogénéisateur pour 40 s avec une valeur de 6.0, puis centrifuger le tube à 12000 × g et 4 ° C pendant 5 min.
      3. Après centrifugation, transférer la phase supérieure dans un nouveau tube de microcentrifuge.
      4. Incuber l’échantillon transféré pendant 5 min à température ambiante ; Ajouter 300 µL de chloroforme, Vortexer pendant 10 s et puis incuber pendant 5 min à température ambiante.
      5. Centrifuger le tube à 12000 × g et 4 ° C pendant 5 min. transfèrent la phase supérieure dans un nouveau tube.
      6. Ajouter 500 µL d’éthanol absolu froid dans le tube, avant de ce coucher pour 5 fois et ensuite stocker l’échantillon à-20 ° C pendant au moins 1 h.
      7. Centrifuger le tube à 12000 × g et 4 ° C pendant 15 minutes et enlever le surnageant. Laver le culot avec 500 µL d’éthanol froid à 75 % en exempte de RNase H2O.
      8. Supprimer l’éthanol, l’air sec le granule pendant 5 min à température ambiante et remettre l’ARN dans 100 µL d’exempte de RNase H2O.
      9. Incuber l’ARN pendant 5 min à température ambiante et déterminer la concentration d’ARN à l’aide d’un bioanalyzer RNA.
    2. Effectuer la synthèse de cDNA, notamment l’élimination de l’ADN génomique (ADNg), en utilisant un thermocycleur avec un kit de réactif de transcription inverse (RT).
      1. Ajouter 1 µg d’ARN à un tube contenant 2 µL de tampon d’élimination 5 x gDNA, 1 µL d’enzyme élimination ADNg et exempte de RNase H2O jusqu'à ce que le volume atteint 10 µL. Incuber pendant 2 min à 42 ° C.
      2. Ajouter 10 µL du mélange principal (1 µL d’enzyme RT Mix I, 1 µL du mélange Primer RT, 4 µL de 5 x 2 de tampon et 4 µL d’exempte de RNase H2O) à la solution de réaction de la dernière étape et puis mélanger doucement. Procéder immédiatement à la réaction de RT : 37 ° C pendant 15 minutes et puis 85 ° C pendant 5 s.
      3. Effectuer l’analyse quantitative de PCR (RT-qPCR) en temps réel à l’aide d’une machine de PCR en temps réel avec un kit du RT-qPCR SYBR. Ajouter 10 µL de 2 x enzyme, 0,8 µL d’apprêt avant, 0,8 µL d’apprêt inverse, 0,4 µL de 50 x ROX référence Dye II, 2 µL de matrice d’ADNc et exempte de RNase H2O jusqu'à un volume total de 20 µL.
      4. Exécuter chaque échantillon en triple exemplaire, en utilisant les paramètres thermiques suivantes : 30 s à 94 ° C, suivie de 40 cycles de 5 s à 95 ° C et 34 s à 60 ° C, avec une phase finale de 15 s à 95 ° C, 1 min à 60 ° C et 15 s à 95 ° C. Amorces pour la RT-qPCR sont énumérés au tableau 1. Gènes domestiques B2m et 18 s ARNr ont été utilisés comme contrôles internes.
    3. Calculer la variation de pli relative basée sur la méthode 2-ΔΔCt .
  3. Observation de coupes histologiques
    1. Après fixation 24h avec 10 % de formol, reconstruire le tissu cérébral fixe en grandeurs appropriées de morceaux de tissus à 2-3 mm.
    2. Mettez les morceaux de tissus dans une cassette d’encastrement et plongez dans une nouvelle solution de fixateur pour déshydratation avec un déshydrateur automatique sous vide.
    3. Retirez le tissu fixe et il déshydrate séquentiellement dans l’augmentation des concentrations d’éthanol (70 %, 80 %, 95 %, 95 % et 100 %) pendant 30 min dans chaque solution.
    4. Transparentize l’échantillon avec le xylène pendant 15 min, trempez-le dans la paraffine liquide à 60 ° C pendant 90 min et ensuite incorporer à l’aide d’une machine d’enrobage.
    5. Couper le tissu de bloc intégré de paraffine en tranches de 3 µm, tuile de la tranche sur l’eau à 45 ° C et puis le sécher à l’air.
    6. Incuber la section pendant 3 h à 60 ° C, détachant à l’aide de l’hématoxyline et éosine (HE) méthode et scellez-la avec la gomme neutre.
    7. Observer les changements histopathologiques du cerveau avec un microscope optique. Un système de classement de quatre points a été utilisé pour évaluer les changements histologiques. Utiliser un test de non-appariés t pour l’analyse statistique.
      Congestion/hémorragie : absent, marquez 0 ; petite zone de congestion focal/hémorragie, note 1 ; grande zone de congestion/hémorragie focale, ou plusieurs sites de petite zone de congestion focal/hémorragie, note 2 ; jusqu'à trois sites grande congestion/hémorragie focale, note 3 ; diffuse la congestion/hémorragie, Marquez 4.
      Nécrose : absent, marquez 0 ; nécrose focale, note 1 ; diffuse la présence de 1-10 cellules nécrotiques, note 2 ; foyers de nécrose confluente, note 3 ; une nécrose étendue confluente, note 4.
      Une infiltration cellulaire inflammatoire : absent, marquez 0 ; les infiltrations peu et focales, note 1 ; infiltration multifocale ou infiltrations avec formation d’agrégats, note 2 ; jusqu'à trois agrégats, note 3 ; et plus de quatre agrégats, note 4.

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Résultats

SEM analyse a été réalisée afin d’examiner la formation du biofilm dans les conditions expérimentales. Comme illustré à la Figure 1, il y a une différence significative dans la formation de biofilm entre cellules planctoniques (Figure 1A) et biofilm État (Figure 1B). SEM analyse a montré que les biofilms bactéries étaient en touffes et plusieurs couches et ils ont en...

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Discussion

La voie intracrânienne subarachnoïdien d’infection décrite ici a des avantages évidents sur les autres voies d’infection. Il permet aux chercheurs d’étudier l’interaction hôte-bactérie et l’effet des composantes bactériennes sur les réponses immunitaires hôte directement dans le cerveau, qui miment l’entrée bactérienne dans le système nerveux central. Ainsi, cette voie d’infection peut être étendue pour étudier les mécanismes de la méningite causée par d’autres bactéries. En outre, il peut également être utilisé pour tes...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions du National Key Research and Development Programme of China [2017YFD0500102] ; la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine [31572544] ; le laboratoire clé Etat des vétérinaire biologie étiologique [SKLVEB2016KFKT005] ; l’Agriculture de Shanghai Applied Technology Development Programme, Chine [G2016060201].

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bouillon Todd Hewitt(THB)Becton, Dickinson and CompanyDF0492078Dissoudre 30 g de poudre dans 1 L d’eau purifiée. Autoclave à 121° ; pendant 15 min.
AgarDSBIO16C0050Dissoudre 15 g de poudre dans 1 L de THB. Autoclave à 121° ; pendant 15 min.
Système de purification d’eau de référence Milli-QMerck KGaAZ00QSVCUSsans Dnase/ Rnase
NaClTianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd10019318Dissoudre 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 dans 1 L d’eau purifiée. Autoclave à 121° ; pendant 15 min. Utilisez le KOH pour ajuster le pH à 7,4.
Na2HPO3Xilong Scientific Co., Ltd9009012-01-09Dissoudre 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 dans 1 L d’eau purifiée. Autoclave à 121° ; pendant 15 min. Utilisez le KOH pour ajuster le pH à 7,4.
KClXilong Scientific Co., Ltd9009017-01-09Dissoudre 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 dans 1 L d’eau purifiée. Autoclave à 121° ; pendant 15 min. Utilisez le KOH pour ajuster le pH à 7,4.
KH2PO4Xilong Scientific Co., Ltd9009019-01-09Dissoudre 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 dans 1 L d’eau purifiée. Autoclave à 121° ; pendant 15 min. Utilisez le KOH pour ajuster le pH à 7,4.
KOHXilong Scientific Co., Ltd9009014-01-09Dissoudre 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 dans 1 L d’eau purifiée. Autoclave à 121° ; pendant 15 min. Utilisez le KOH pour ajuster le pH à 7,4.
GlycérolSionpharm Chemical Reagent Co., Ltd10010618Dilué avec un volume égal d’eau purifiée, autoclave à 121° ; pendant 15 min
4 % de paraformaldéhydeSionpharm Chemical Reagent Co., Ltd80096675
25 % de glutaraldéhydeSionpharm Chemical Reagent Co., Ltd3009243610 fois dilué avec de l’eau purifiée pour la fixation.
EthanolSionpharm Chemical Reagent Co., Ltd10009218
ChloroformSionpharm Chemical Reagent Co., Ltd10006818
SpctrophotometreDeNovix Inc.DS-11+
Broyeur de cellules à ultrasonsNingBo Scientz Biotechnology Co., LtdJY96-IIN
CentrifugeuseHitachi Koki Co., LtdCT15RE
RéfrigérateurAucma Co., LtdDW-86L500
Microscope électronique à balayageZeissEVO-LS10
FastRNA Pro Green KitMP Biomedicals#6045-050
FastPrep-24 InstrumentMP Biomedicals116005500
Instrument pour PCRSensoQuest GmbH1124310110
QuantStudio 6 FlexThermo Fisher Scientific4485689
SYBR Premix Ex Taq IITakara Biomedical Technology (Beijing) Co., LtdRR820A
Kit de réactifs PrimeScript RT avec effaceurd’ADNgTakara Biomedical Technology (Beijing) Co., LtdRR047A
Processeur de tissus entièrement ferméLeica Biosystems Nussloch GmbHASP200S
Module d’enrobage de paraffine chaufféeLeica Biosystems Nussloch GmbHEG1150H
Microtome rotatif semi-automatiséLeica Biosystems Nussloch GmbHRM2245
Bain-marie pour sections de paraffineLeica Biosystems Nussloch GmbHHI1210
Autostainer XLLeica Biosystems Nussloch GmbHST5010
Agilent 2100Agilent TechnologiesG2939A
Microscope optiqueOlympusBX51

Références

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