שיטת הכנה מדגם יעיל לשיפור אותות יון פחמימות לייזר בסיוע מטריקס Desorption/יינון ספקטרומטריית
Summary
פרוטוקול לשיפור אותות יון פחמימות ספקטרומטריית MALDI על ידי מבנים גבישיים רפורמה במהלך תהליכי הכנה מדגם הוא הפגין.
Abstract
הכנת הדוגמא היא תהליך קריטי בניתוח ספקטרומטר מסה (MS) של פחמימות. למרות לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון (MALDI) MS הוא שיטת הבחירה בניתוח פחמימות, יון המסכן הפארמצבטית אותות ונתונים של פחמימות דגימות ממשיכות להיות בעיות קשות. לניתוח כמותי של פחמימות, פרוטוקול אנליטי יעיל לספק איכות מעולה הנתונים יש צורך. וידאו זה מדגים דוגמת פרוטוקולים הכנה כדי לשפר את עוצמת האות ולצמצם את הנתונים וריאציה של פחמימות MALDI-MS. לאחר ייבוש, התגבשות של מדגם טיפות, המורפולוגיה קריסטל תוקן על ידי מתנול לפני ניתוח המוני spectrometric. שיפור פחמימות אות נבדק עם MALDI הדמיה ספקטרומטר מסה (IMS). תוצאות ניסויית להראות כי קריסטל הרפורמציה התאמת מבנים גבישיים, מפזרת מחדש פחמימות analytes. לעומת שיטת הכנה droplet יבשים MALDI קונבנציונלי-MS, רפורמה מורפולוגיות קריסטל פחמימות עם מתנול מראה עוצמת האות טוב יותר באופן משמעותי, יון התמונה התפלגות נתוני יציבות. מאז הפרוטוקולים הפגינו בזאת אינן כוללות שינויים בהרכב לדוגמה, הם חלים באופן כללי על פחמימות שונים, מטריצות.
Introduction
ניתוח פחמימות הוא נושא חשוב ומאתגר. פחמימות ונגזרותיהם תפקיד חשוב לחיות אורגניזמים1,2,3. מולקולות אלה סיבכו מבנים, נוטים מתפרקים. רבים מהם לא יכול להיות ברור מאופיין בשל קשיים הפרדה וזיהוי. למרות לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון (MALDI) ספקטרומטר מסה (MS) הוחלה על ניתוח של מגוון רחב של מולקולות, בשל הרגישות שלה תוצאות מובנים4, ניתוח פחמימות באמצעות MALDI-MS ממשיכה להיות אתגר גדול בשל היעילות יינון נמוכה של מולקולות כאלה5. Derivatization כימית היא דרך נפוצה כדי לשפר את יעילות יינון של פחמימות6,7, אבל הליכים כאלה הם לדוגמה לצרוך וזמן. חוץ מזה, היעילות יינון של פחמימות derivatized הוא עדיין נמוך מזה של חלבונים. לפיכך, בפיתוח שיטות לשיפור האות פחמימות MALDI-MS ללא פרוצדורות מסובכות הכרחי.
היישום של MALDI-MS כדי ניתוח כמותי הוא נושא מאתגר אחר. אחת הבעיות המרכזיות של MALDI-MS היא כי שלה הפארמצבטית רגישות ונתונים מסתמך באופן ביקורתי על מדגם הכנת פרוטוקולים ופרמטרים ניסיוני. במקרים רבים, ניתוח כמותי על-ידי MALDI-MS הוא לא אמין עקב מדגם הטרוגנית מורפולוגיות והפצה analyte. דוגמה ידועה היא דגימות המוכנים מטריצה (DHB) MALDI 2, 5-dihydroxybenzoic חומצה. כאשר DHB הוא גיבש אט-אט תחת סביבת אמביינט, מידת השתלבות analyte מטריקס קריסטלים הוא בלתי צפוי, כי תוצאות דגימות הראו מורפולוגיות לא סדיר. דוגמאות כאלה בדרך כלל מורכב גבישים גדולים בצורת מחט, בסדר. כאשר DHB מוכנה תוך שימוש של ממס נדיף ו/או צלחת המדגם מחומם, תהליך ייבוש מהיר התוצאה קריסטלים בסדר הומוגנית יותר תוצאות כמותיות8,9,10. טכניקה זו ידועה בשם “recrystallization” של דגימות MALDI. השיפור מיוחס יותר תיאגוד analytes לתוך מטריצה בסדר קריסטלים במהלך תהליך התגבשות מהר. גם הראו כי התאמת הסביבה הכנה מדגם צמצם את הטרוגניות של פחמימות אות ושיפור תוצאות כמותיות11,12. הממצאים בעבודות אלה מראים כי מדגם המורפולוגיה היא גורם קריטי בקביעת איכות אות פחמימות. כדי לפתח אסטרטגיה כללית לניתוח יומי, שיטה הרפורמציה מדגם יעיל במתן פחמימות משופרת רגישות נדרש.
בחנו באופן שיטתי המתאם בין מדגם מורפולוגיה, פחמימות רגישות ב MALDI-MS דו ח זה התבצעה13. התוצאות שהושגו באמצעות כמה פחמימות חשובה, הצג מטריצות שיפור האות הטוב ביותר מתגשמת מאת recrystallizing מיובשים MALDI דגימות. המורפולוגיה של דגימות שהוכנו בשיטת רביב מיובשות קונבנציונליות (DD) תוקן על ידי recrystallization מהיר עם מתנול (MeOH). הפרוטוקולים הכנה מפורטת מדגם מודגמות כאן. הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים, כולל מדגם פלייט preconditioning, דוגמת התצהיר, recrystallization, וניתוח ספקטרומטר מסה. הפחמימות שימוש כוללים sialyl-לואיס (מירה כהןA), maltoheptaose (MH). DHB משמש מודל מטריצה. התוצאות מציגות עוצמת האות פחמימות והפצה המרחבי השתפר בצורה ניכרת אחרי recrystallization. השיטה ניתן ליישם דגימות עם מטריצות פופולריים אחרים, כולל 2,4,6-trihydroxyacetophenone (תאפ) וα– cyano-4-hydroxycinnamic חומצה. שיטה זו משמשת בגישה כללית אשר ניתן לשלב בקלות בתוך השגרה מעבדה לניתוח פחמימות.
Protocol
Representative Results
Discussion
לדוגמה הטרוגניות היא שבעיה מכרעת בדמוקרטיה. גברת MALDI הוא הכי נפוץ שיטת הכנה דגימה, אך הקריסטלים תוצאות מאוד הטרוגנית. דוגמאות כאלה מציגות הפארמצבטית נמוכה של אות ירה–ירייה, לדוגמה-כדי-sample. לכן, בחיפוש אחר “מתוק כתמים” באזורים דוגמת במהלך איסוף הנתונים הוא הליך נפוץ בניסויים MALDI. . הדגימות הט?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים לא תודות לך
Materials
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) | Alfa Aesar | A11459 | |
| sialyl-lewis A (SLeA) | Sigma-Aldrich | S1782 | |
| Maltoheptaose | Sigma-Aldrich | M7753 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 mL beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Mini centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | This lab | ||
| Ultraflex II TOF/TOF mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| MTP 384 target plate polished steel BC | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Flexcontrol Version 3.4 | Bruker Daltonics | Control software | |
| Fleximaging Version 2.1 | Bruker Daltonics | Imaging software | |
| Flexanalysis Version 3.4 | Bruker Daltonics | Analysis software |
References
- Holme, D. J., Peck, H. . Analytical Biochemistry. , (1998).
- Costello, C. E. Time, life … and mass spectrometry – New techniques to address biological questions. Biophysical Chemistry. 68 (1-3), 173-188 (1997).
- Caroff, M., Karibian, D. Structure of bacterial lipopolysaccharides. Carbohydrate Research. 338 (23), 2431-2447 (2003).
- Marvin, L. F., Roberts, M. A., Fay, L. B. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in clinical chemistry. Clinica Chimica Acta. 337 (1), 11-21 (2003).
- Harvey, D. J. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates. Mass Spectrometry Reviews. 18 (6), 349-450 (1999).
- Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydrate Research. 131 (2), 209-217 (1984).
- Lamari, F. N., Kuhn, R., Karamanos, N. K. Derivatization of carbohydrates for chromatographic, electrophoretic and mass spectrometric structure analysis. Journal of Chromatography B. 793 (1), 15-36 (2003).
- Nishikaze, T., Amano, J. Reverse thin layer method for enhanced ion yield of oligosaccharides in matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (23), 3787-3794 (2009).
- Williams, T. I., Saggese, D. A., Wilcox, R. J., Martin, J. D., Muddiman, D. C. Effect of matrix crystal structure on ion abundance of carbohydrates by matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21 (5), 807-811 (2007).
- Nicola, A. J., Gusev, A. I., Proctor, A., Jackson, E. K., Hercules, D. M. Application of the fast-evaporation sample preparation method for improving quantification of angiotensin II by matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9 (12), 1164-1171 (1995).
- Lai, Y. H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1314-1321 (2016).
- Ou, Y. -. M., et al. Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications. Journal of Visualized Experiments. (116), e54409 (2016).
- Lee, H., et al. Enhancing carbohydrate ion yield by controlling crystalline structures in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. , 49-55 (2017).
- Allwood, D. A., Perera, I. K., Perkins, J., Dyer, P. E., Oldershaw, G. A. Preparation of ‘near’ homogeneous samples for the analysis of matrix-assisted laser desorption/ionisation processes. Applied Surface Science. 103 (3), 231-244 (1996).
- Sadeghi, M., Vertes, A. Crystallite size dependence of volatilization in matrix-assisted laser desorption ionization. Applied Surface Science. 127 (Supplement C), 226-234 (1998).
