تصنيع نانوباتيرن التدرج الحراري نانويمبرينتينج تقنية والفحص لاستجابة الخلايا البشرية تشكيل مستعمرة غشائي
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتصنيع لوحات نانوباتيرن التدرج عبر نانويمبرينتينج الحرارية وطريقة فحص استجابات الخلايا البشرية السلف بطانية للنانو. باستخدام هذه التكنولوجيا الموصوفة، من الممكن لإنتاج سقالة التي يمكن التعامل مع سلوك الخلية بالمحفزات المادية.
Abstract
نانوتوبوجرافي يمكن العثور عليها في مختلف المصفوفات خارج الخلية (ECMs) في جميع أنحاء الجسم، ومن المعروف أن لديها الإجراءات التنظيمية الهامة عليها التفاعلات الخلوية. ومع ذلك، من الصعب تحديد العلاقة بين حجم نانوستروكتوري والردود الواردة من الخلايا نظراً لعدم وجود أدوات الفحص السليم. وهنا نعرض وضع لوحات نانوباتيرن التدرج استنساخه وفعالة من حيث التكلفة للتلاعب بالاستجابات الخلوية. استخدام أكسيد الألومنيوم انوديك (AAO) كقالب رئيسي، لوحات نانوباتيرن التدرج مع نانوبيلارس لزيادة قطرها يتراوح [120-200 نانومتر (GP 120/200) و 200-280 نانومتر (سباق الجائزة الكبرى 200/280) 280-360 نانومتر (GP 280/360)] كانت ملفقة من حرارية ولﻷخذ تقنية. هذه اللوحات نانوباتيرن التدرج صممت لتحاكي مختلف الأحجام من نانوتوبوجرافي في إدارة المحتوى في المؤسسة واستخدمت لفحص استجابات الخلايا البطانية البشرية تشكيل مستعمرة (هيكفكس). في هذا البروتوكول، يمكننا وصف الإجراء خطوة بخطوة من اختﻻق لوحات نانوباتيرن التدرج للخلية الهندسة وتقنيات زراعة هيكفكس من الدم المحيطي البشري، واستزراع هيكفكس على لوحات نانوباتيرن.
Introduction
في الآونة الأخيرة، قد تم الأضواء استجابة الخلايا بالتحفيز المادي لتضاريس السطح في مجال الخلية الهندسة1،2،،من34. ولذلك، انصب الاهتمام أكثر في النانو ثلاثية الأبعاد في الخلية السطحية المرفق5. وأفيد أن إنتغرين، الذي هو الجهاز التعرف على سطح الخلية، ويحيل الحافز المادي مدفوعا بهياكل نانو الصغيرة لإدارة المحتوى في المؤسسة من خلال توصيل mechano6. ينظم سلوك الخلية من خلال التوجيه الاتصال7 هذا التحفيز الميكانيكي والحث على إعادة تنظيم سيتوسكيليتال تغيير الشكل، بالإضافة إلى التنسيق الالتصاقات وتصلب الخلايا8.
الخلايا البشرية السلف غشائي (هيبكس) في الجسم التفاعل عن كثب مع المكروية ECM المحيطة بها9. وهذا يشير إلى أن الحالة المادية لإدارة المحتوى في المؤسسة مثابة معياراً هاما للخلية المحددة-المصفوفة المعقدة التصاق تشكيل قدر إجهاد القص المستمدة من تدفق الدم10. وأفيد أن نانوتوبوجرافي السطحية ويعزز تشكيل شبكات أنابيب شعرية واسعة من هيبكس11 في المختبر وأن عاملاً لذوبان ECM/بيو مجتمعة نظام يتيح هيبكس الاعتراف بركائز مختلة ويعزز الجرح الشفاء12،13. ومع ذلك، لا يفهم وضوح العلاقة بين إدارة المحتوى في المؤسسة وهيبكس.
على الرغم من أن العديد من الباحثين حاولوا توضيح العلاقة بين استجابات الخلية والرموز المادية من ركائز مختلفة14،،من1516، هذه الدراسات تستخدم فقط في حجم ثابت من نانوستروكتوري أو نانوباتيرنس مع الترتيبات غير النظامية التي لها حد توضيح العلاقة بين حجم السلوك نانوستروكتوري وخلية. والمشكلة هنا هو الافتقار إلى الأدوات المناسبة لفحص الاستجابات الخلوية التي يمكن استبدال النهج القائمة مملة ومتكررة لإيجاد الحجم الأمثل نانوستروكتوري. ولذلك، مطلوب تقنية مباشرة لفحص ردود الفعل خلية على التحفيز الجسدي دون تكرار.
هنا، يمكننا وصف أسلوب يستخدم في أعمالنا السابقة تقارير18،،من1719 لإنتاج نانوباتيرن تدرج فيها قطر نانوبيلارس مرتبة يزيد تدريجيا. وبالإضافة إلى ذلك، نحن أيضا وصف كيفية زراعة وتحليل سلوك هيكفكس في لوحات نانوباتيرن التدرج لتحديد تأثير المحفزات المادية على الخلايا. واستخدمت anodization معتدل، والنقش تدريجيا، وأسلوب طلاء طبقة اللصق المضادة اختﻻق التدرج AAO العفن. وباعتماد حرارية ولﻷخذ تقنية الطباعة الحجرية، أنتجت نانوباتيرنس التدرج البوليستيرين متطابقة بطريقة فعالة من حيث التكلفة وسهلة. استخدام التدرج نانوباتيرنس، أنه من الممكن لتحديد حجم نانوستروكتوري له تأثير كبير على سلوك الخلية في مجموعة واحدة من التجربة. ونحن نتوقع أن هذا التدرج نانوباتيرن سوف تكون مفيدة في فهم آليات التفاعل بين هيكفك المستمدة من الدم أو الخلايا الأخرى وأحجام مختلفة من النانو.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصنيع AAO غالباً ما يعاني من عيوب مثل الشقوق، والأشكال غير النظامية من المسام، وحرق. والسبب الرئيسي لهذه العيوب يسمى تفصيل كهربائياً، التي تتأثر بشدة بطبيعة الركازات المعدنية يجري أكسيد والمقاومة ل الكهرباء21. نظراً للمقاومة للكهرباء تختلف تبعاً لدرجة الحرارة، القضاء على الح?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها “برنامج بحوث العلوم الأساسية” عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) الممولة من وزارة التربية والتعليم، والعلوم والتكنولوجيا (MEST) [جبهة الخلاص الوطني-2015R1D1A1A01060397] والحيوية وتطوير التكنولوجيا الطبية برنامج تموله وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات وتخطيط المستقبل [جبهة الخلاص الوطني-2017M3A9C6029563] جبهة الخلاص الوطني.
Materials
| Perchloric acid 60% | Daejung Chemicals & Metals | 6512-4100 | |
| Ethyl alcohol, absolute 99.9% | Daejung Chemicals & Metals | 4118-4100 | |
| Phosphoric acid 85% | Daejung Chemicals & Metals | 6532-4400 | |
| Methyl alcohol 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 5558-4400 | |
| Chromium(VI) oxide | Daejung Chemicals & Metals | 2558-4400 | |
| Sulfuric acid 95% | Daejung Chemicals & Metals | 7781-4100 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Daejung Chemicals & Metals | 4104-4400 | |
| n-hexane 95% | Daejung Chemicals & Metals | 4081-4400 | |
| Toluene 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 8541-4400 | |
| (heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane | Gelest | SIH5840.4 | Moisture sensitive |
| Methoxynonafluorobutane 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| Collagen solution | Stemcell | #4902 | |
| Gelatin | Sigma aldrich | G1890 | Protein coating solution |
| Ficoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Hydrophilic polysaccharide solution |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Endothelial cell expansion medium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010031 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldehyde | Sigma aldrich | P6148 | |
| Glutaraldehyde | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Osmium tetroxide | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Octylphenol ethoxylate |
| Goat serum | Gibco | 26050-088 | |
| anti-human vinculin primary antibody | Sigma aldrich | V9131 | |
| F-actin probe | Molecular Probes | A12379 | Fluorescence-conjugated phalloidin |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A11001 | Fluorescence-conjugated secondary antibody |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Sigma aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Anti-human vWF primary antibody | DAKO | A0082 | |
| Anti-human CD144 primary antibody | BD Biosciences | #555661 | |
| Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA | Ted Pella | 18012 | Epoxy resin |
| Uranyl Acetate, 25g | Ted Pella | 19481 | |
| Lead Citrate, Trihydrate, 10g | Ted Pella | 19312 | |
| Ultra pure aluminum plate | Goodfellow | 26050-088 | |
| Polystyrene sheet | Goodfellow | ST313120 | |
| 8.0" silicon wafer | Siltron | 29-01024-03 | Single side polished, 725 µm thick |
| Vacuum desiccator, 4.4 L | Kartell | KA.230 | |
| Vacuum pump | Vacuumer | V3.VOP100 | |
| Power supply | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Magnetic stirrer | Daihan scientific | SL.SMS03022 | |
| Overhead stirrer | Daihan scientific | HT120DX | |
| Circulator | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Linear moving stage | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Angle bracket, 90 degrees | Zaber | AB90M | Accessory of the linear moving stage |
| PMP forcep, 145 mm | Vitlab | 67995 | Nonmetallic tweezer |
| PTFE beaker, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | B2510MTH | |
| PCB cutter | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
| Nanoimprint device | Nanonex | NX-2000 | |
| Oxygen plasma generator | Femto Science | CUTE | |
| Low temperature sterilizer | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Confoal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM6701 | |
| Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
References
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
- Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
- Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
- Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101 (2017).
- Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
- Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
- Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
- Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
- Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
- Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
- Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
- Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
- Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394 (2012).
- Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
- Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
- Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632 (2017).
- Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
- Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
- Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
- Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466 (1995).
- Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126 (1996).
- Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
- Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
- Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).
