Herstellung von Gradient Nanopattern durch thermische Nanoimprinting Technik und Screening der Reaktion des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Fertigung der gradient Nanopattern Platten über thermische Nanoimprinting und die Methode der screening-Antworten der menschlichen endotheliale Vorläuferzellen in Nanostrukturen. Durch den Einsatz der beschriebenen Technologie ist es möglich, ein Gerüst zu produzieren, die Zelle Verhalten durch physikalische Reize bearbeiten können.
Abstract
Nanotopography finden sich in unterschiedlichen extrazellulären Matrizen (ECMs) um den Körper und ist bekannt als wichtige regulatorische Maßnahmen auf zelluläre Reaktionen haben. Allerdings ist es schwierig, das Verhältnis zwischen der Größe einer Nanostruktur und die Reaktionen der Zellen aufgrund der mangelnden richtigen Screening-Tools bestimmen. Hier zeigen wir die Entwicklung von reproduzierbaren und kostengünstige gradient Nanopattern Platten für die Manipulation von zellulären Antworten. Mit anodische Aluminiumoxid (AAO) als ein master-Form, gradient Nanopattern Platten mit Nanopillars der zunehmenden Durchmesserbereiche [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) und 280-360 nm (GP 280/360)] wurden durch eine thermische Prägung Technik hergestellt. Diese Gradienten Nanopattern Platten wurden entwickelt, um die verschiedenen Größen des Nanotopography in das ECM zu imitieren und wurden verwendet, um die Reaktionen des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen (hECFCs) Bildschirm. In diesem Protokoll beschreiben wir Schritt für Schritt Verfahren der Herstellung von gradient Nanopattern Platten für Zelle engineering, Techniken der hECFCs aus dem menschlichen peripheren Blut zu kultivieren und Kultivierung von hECFCs auf Nanopattern Platten.
Introduction
Vor kurzem hat die Reaktion der Zellen durch die physische Stimulation der Oberflächentopographie im Bereich der Zelle engineering1,2,3,4angestrahlt wurden. Daher konzentriert sich stärker auf dreidimensionale Nanostrukturen auf der Zelle Oberfläche Anlage5. Es wurde berichtet, dass der Integrin, das die Oberfläche Anerkennung Gerät der Zelle ist, die körperliche Anregung angetrieben durch die Mikro-Nano-Strukturen der ECM durch Mechano-Transduktion6überträgt. Diese mechanische Stimulation reguliert Zelle Verhalten durch Kontakt Leitung7 und induziert Zellskelett Reorganisation, Form, neben der fokalen Adhäsionen und Steifigkeit der Zellen8zu ändern.
Menschlichen endotheliale Vorläuferzellen (hEPCs) im Körper arbeiten eng mit der Mikroumgebung von den umliegenden ECM-9. Dies bedeutet, dass der physikalische Zustand des ECM als ein wichtiger Parameter für die spezifische Zellmatrix Adhäsion Komplexbildung wirkt soviel Blut fließen10Schubspannung abgeleitet. Es wird berichtet, dass die Oberfläche Nanotopography verbessert die in-vitro- Netzwerkbildung umfangreiche Kapillarrohr hEPCs11 und, dass ein ECM/Bio löslicher Faktor System kombiniert ermöglicht hEPCs, dysfunktionalen Substrate zu erkennen und fördert die Wunde heilen12,13. Dennoch ist das Verhältnis von ECM und hEPCs nicht klar.
Obwohl viele Forscher versucht zu klären, die Beziehung zwischen Zell-Reaktionen und körperliche Signale von verschiedenen Substraten14,15,16, verwendet diese Studien nur die feste Größe von einer Nanostruktur oder Nanopatterns mit unregelmäßigen Arrangements, die eine Beschränkung auf die Beziehung zwischen der Größe der Zelle und Nanostrukturen Verhalten aufzuklären haben. Das Problem hier ist ein Mangel an geeigneten Werkzeugen für das screening von zellulärer Reaktionen, die bestehende mühsam und iterative Ansätze zu finden, die optimale Größe der Nanostruktur ersetzen können. Daher ist eine einfache Technik für das screening von Zelle Reaktionen auf körperliche Reize ohne Wiederholung erforderlich.
Hier beschreiben wir eine Methode in unsere früheren Berichte17,18,19 , um ein gradient Nanopattern zu produzieren, in denen der Durchmesser der angeordneten Nanopillars schrittweise erhöht. Darüber hinaus beschrieben wir auch, wie man pflegen und analysieren das Verhalten von hECFCs auf gradient Nanopattern Platten zu ermitteln, die Wirkung von physikalischen Reize auf die Zellen. Eine milde Anodisierung, stufenweisen Ätzen und Anti-sticking Layer Beschichtungsverfahren dienten gradient AAO Schimmel zu fabrizieren. Durch die Annahme einer thermisches Prägung Lithographie-Technik, wurden identische Polystyrol gradient Nanopatterns auf eine kostengünstige und einfache Weise hergestellt. Mit Farbverlauf Nanopatterns ist es möglich, festzustellen, welche Größe der Nanostruktur hat einen großen Einfluss auf Zelle Verhalten in einem Experiment. Wir erwarten, dass dieser gradient Nanopattern hilfreich sind für das Verständnis der Mechanismen der Interaktion zwischen Blut abgeleitet hECFC oder andere Zellen und Nanostrukturen in verschiedenen Größen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Herstellung von einem AAO oft weist Mängel wie Risse, unregelmäßige Formen von Poren und brennen. Der Hauptgrund für diese Mängel ist eine elektrolytische Zusammenbruch, die stark von der Art der Metall Substrate werden eloxiert und der Widerstandsfähigkeit der Elektrolyt21betroffen ist. Da der Widerstand des Elektrolyten abhängig von seiner Temperatur schwankt, ist die Beseitigung der Hitze kontinuierlich von Elektroden der kritische Punkt, die standortbezogene Temperatur des Elektrolyten …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch das Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] und Bio & medizinische Technologieentwicklung unterstützt. Programm der NRF finanziert durch das Ministerium für Wissenschaft, ICT & Zukunft planen [NRF-2017M3A9C6029563].
Materials
| Perchloric acid 60% | Daejung Chemicals & Metals | 6512-4100 | |
| Ethyl alcohol, absolute 99.9% | Daejung Chemicals & Metals | 4118-4100 | |
| Phosphoric acid 85% | Daejung Chemicals & Metals | 6532-4400 | |
| Methyl alcohol 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 5558-4400 | |
| Chromium(VI) oxide | Daejung Chemicals & Metals | 2558-4400 | |
| Sulfuric acid 95% | Daejung Chemicals & Metals | 7781-4100 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Daejung Chemicals & Metals | 4104-4400 | |
| n-hexane 95% | Daejung Chemicals & Metals | 4081-4400 | |
| Toluene 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 8541-4400 | |
| (heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane | Gelest | SIH5840.4 | Moisture sensitive |
| Methoxynonafluorobutane 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| Collagen solution | Stemcell | #4902 | |
| Gelatin | Sigma aldrich | G1890 | Protein coating solution |
| Ficoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Hydrophilic polysaccharide solution |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Endothelial cell expansion medium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010031 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldehyde | Sigma aldrich | P6148 | |
| Glutaraldehyde | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Osmium tetroxide | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Octylphenol ethoxylate |
| Goat serum | Gibco | 26050-088 | |
| anti-human vinculin primary antibody | Sigma aldrich | V9131 | |
| F-actin probe | Molecular Probes | A12379 | Fluorescence-conjugated phalloidin |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A11001 | Fluorescence-conjugated secondary antibody |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Sigma aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Anti-human vWF primary antibody | DAKO | A0082 | |
| Anti-human CD144 primary antibody | BD Biosciences | #555661 | |
| Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA | Ted Pella | 18012 | Epoxy resin |
| Uranyl Acetate, 25g | Ted Pella | 19481 | |
| Lead Citrate, Trihydrate, 10g | Ted Pella | 19312 | |
| Ultra pure aluminum plate | Goodfellow | 26050-088 | |
| Polystyrene sheet | Goodfellow | ST313120 | |
| 8.0" silicon wafer | Siltron | 29-01024-03 | Single side polished, 725 µm thick |
| Vacuum desiccator, 4.4 L | Kartell | KA.230 | |
| Vacuum pump | Vacuumer | V3.VOP100 | |
| Power supply | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Magnetic stirrer | Daihan scientific | SL.SMS03022 | |
| Overhead stirrer | Daihan scientific | HT120DX | |
| Circulator | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Linear moving stage | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Angle bracket, 90 degrees | Zaber | AB90M | Accessory of the linear moving stage |
| PMP forcep, 145 mm | Vitlab | 67995 | Nonmetallic tweezer |
| PTFE beaker, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | B2510MTH | |
| PCB cutter | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
| Nanoimprint device | Nanonex | NX-2000 | |
| Oxygen plasma generator | Femto Science | CUTE | |
| Low temperature sterilizer | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Confoal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM6701 | |
| Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
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