ייצור של מעבר צבע Nanopattern על ידי טכניקת Nanoimprinting תרמית והקרנת התגובה של תאים אנושיים המושבה יוצרי אנדותל
Summary
כאן, אנו מציגים עבור הזיוף של צלחות nanopattern מעבר צבע באמצעות nanoimprinting תרמי ואת שיטת הקרנה התגובות של האדם ובתאים אנדותל nanostructures פרוטוקול. באמצעות הטכנולוגיה המתואר, זה אפשרי לייצר לפיגום שיכול להשפיע על התנהגות התא על ידי הגירויים הפיזיים.
Abstract
Nanotopography ניתן למצוא מטריצה חוץ-תאית שונים (ECMs) סביב הגוף וידוע שיש פעולות רגולטוריות חשובות על תגובות הסלולר. עם זאת, קשה לקבוע את היחס בין גודל ננו-מבנה את התגובות של תאים בשל העדר כלים ההקרנה נאותה. כאן, אנו מראים את התפתחות nanopattern מעבר צבע חסכונית הדירים עומדי המניפולציה של תגובות הסלולר. באמצעות אנודי אלומיניום אוקסיד (AAO) כתבנית הבסיס, צלחות nanopattern מעבר צבע עם nanopillars של הגדלת טווחי קוטר [120-200 ננומטר (GP 120/200), 200-280 ננומטר (GP 200/280) ו- 280-360 nm (GP 280/360)] היו מפוברק על ידי תרמית החתמה טכניקה. הצלחות nanopattern הדרגתיות האלה נועדו לחקות את המידות השונות של nanotopography ב- ECM ושימשו למסך את התגובות של אנדותל המושבה יוצרי תאים אנושיים (hECFCs). ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את התהליך צעד אחר צעד של בדיית nanopattern הדרגתיות לוחות עבור תא הנדסה, טכניקות של טיפוח hECFCs מדם היקפי אנושי, culturing hECFCs על צלחות nanopattern.
Introduction
לאחרונה, התגובה של התאים על ידי גירוי פיזי של הטופוגרפיה משטח יש כבר לווק בתחום של תא הנדסה1,2,3,4. לכן, יותר תשומת לב התמקדו nanostructures תלת מימדי-התא מצורף משטח5. בעבר דווח כי אינטגרין, אשר המכשיר זיהוי פני השטח של התא, מעביר את הגירוי הפיזי מונע על ידי מבנה מיקרו-ננו ECM עד mechano-התמרה חושית6. גירוי מכני זה מסדיר בהתנהגות התא באמצעות הדרכה קשר7 ומשרה רה-ארגון cytoskeletal כדי לשנות את הצורה, בנוסף הדבקויות מוקד וקשיחות של תאים8.
האדם אנדותל ובתאים (hEPCs) בגוף מקרוב אינטראקציה עם microenvironment של ה-ECM שמסביב9. אפשרות זו מציינת כי המצב הפיסי של ECM משמש פרמטר חשוב עבור תאים ספציפיים-מטריקס אדהזיה היווצרות מורכבות כמו גזירה נגזר זרימת דם10. הוא דיווח כי nanotopography פני שטח משפר את היווצרות במבחנה של רשתות צינור קפילרי נרחב של hEPCs11 , כך גורם מסיסים ECM/ביו בשילוב המערכת מאפשרת hEPCs לזהות סובסטרטים לקוי ומקדם פצע ריפוי12,13. למרות זאת, היחס בין ה-ECM, hEPCs הוא לא הבין היטב.
אף על פי חוקרים רבים ניסו להבהיר את הקשר בין תא תגובות גופניות רמזים סובסטרטים14,15,16, מחקרים אלה נעשה שימוש רק בגודל קבוע של ננו-מבנה או nanopatterns עם כל הסידורים חריג שיש מגבלה להבהיר את הקשר בין הגודל של ההתנהגות ננו-מבנה ותא. הבעיה כאן היא חוסר כלים מתאימים לסינון תגובות סלולרית שיכולה להחליף קיימות גישות מייגע איטרטיבי כדי למצוא את הגודל האופטימלי של ננו-מבנה. לכן, טכניקה פשוטה נדרש לסינון תגובות תאים על stimulations פיזי ללא חזרה.
כאן, אנו מתארים שיטה המשמשת שלנו הקודם דוחות17,18,19 כדי לייצר nanopattern הדרגה שבה הקוטר של nanopillars מסודרים עולה בהדרגה. בנוסף, אנו גם תיאר כיצד לטפח ולנתח את אופן הפעולה של hECFCs על צלחות nanopattern מעבר צבע כדי לקבוע את ההשפעה של גירוי פיזי על התאים. Anodization מתון, תחריט הדרגתית, שיטת ציפוי שכבה אנטי בלטה שימשו ליצור הדרגתיות AAO עובש. על ידי אימוץ תרמית החתמה טכניקת הדפס אבן, זהה nanopatterns הדרגתיות פוליסטירן יוצרו באופן חסכוני נתיישב. שימוש nanopatterns מעבר הצבע, זה ריאלי כדי לקבוע איזה גודל של ננו-מבנה יש השפעה גדולה על התנהגות התא בסט אחד של הניסוי. אנו מצפים כי nanopattern מעבר צבע זה יהיה מועיל להבנת מנגנוני אינטראקציה בין דם, נגזר hECFC או תאים אחרים גדלים שונים של nanostructures.
Protocol
Representative Results
Discussion
ייצור של AAO לעיתים קרובות סובל פגמים כגון סדקים, צורות לא סדיר של הנקבוביות, וצריבה. הסיבה העיקרית פגמים אלה, נקרא פירוק אלקטרוליטי, אשר מושפע בחוזקה את אופי סובסטרטים מתכת להיות anodized, את resistivity של ה אלקטרוליט21. מאז resistivity של האלקטרוליט משתנה בהתאם לטמפרטורה שלה, סילוק חום ברציפ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על-ידי התוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד החינוך, המדע, הטכנולוגיה (MEST) [ה-NRF-2015R1D1A1A01060397], ביו & פיתוח טכנולוגיות רפואיות תוכנית של ה-NRF במימון של משרד המדע, ICT ותכנון העתיד [ה-NRF-2017M3A9C6029563].
Materials
| Perchloric acid 60% | Daejung Chemicals & Metals | 6512-4100 | |
| Ethyl alcohol, absolute 99.9% | Daejung Chemicals & Metals | 4118-4100 | |
| Phosphoric acid 85% | Daejung Chemicals & Metals | 6532-4400 | |
| Methyl alcohol 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 5558-4400 | |
| Chromium(VI) oxide | Daejung Chemicals & Metals | 2558-4400 | |
| Sulfuric acid 95% | Daejung Chemicals & Metals | 7781-4100 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Daejung Chemicals & Metals | 4104-4400 | |
| n-hexane 95% | Daejung Chemicals & Metals | 4081-4400 | |
| Toluene 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 8541-4400 | |
| (heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane | Gelest | SIH5840.4 | Moisture sensitive |
| Methoxynonafluorobutane 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| Collagen solution | Stemcell | #4902 | |
| Gelatin | Sigma aldrich | G1890 | Protein coating solution |
| Ficoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Hydrophilic polysaccharide solution |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Endothelial cell expansion medium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010031 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldehyde | Sigma aldrich | P6148 | |
| Glutaraldehyde | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Osmium tetroxide | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Octylphenol ethoxylate |
| Goat serum | Gibco | 26050-088 | |
| anti-human vinculin primary antibody | Sigma aldrich | V9131 | |
| F-actin probe | Molecular Probes | A12379 | Fluorescence-conjugated phalloidin |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A11001 | Fluorescence-conjugated secondary antibody |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Sigma aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Anti-human vWF primary antibody | DAKO | A0082 | |
| Anti-human CD144 primary antibody | BD Biosciences | #555661 | |
| Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA | Ted Pella | 18012 | Epoxy resin |
| Uranyl Acetate, 25g | Ted Pella | 19481 | |
| Lead Citrate, Trihydrate, 10g | Ted Pella | 19312 | |
| Ultra pure aluminum plate | Goodfellow | 26050-088 | |
| Polystyrene sheet | Goodfellow | ST313120 | |
| 8.0" silicon wafer | Siltron | 29-01024-03 | Single side polished, 725 µm thick |
| Vacuum desiccator, 4.4 L | Kartell | KA.230 | |
| Vacuum pump | Vacuumer | V3.VOP100 | |
| Power supply | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Magnetic stirrer | Daihan scientific | SL.SMS03022 | |
| Overhead stirrer | Daihan scientific | HT120DX | |
| Circulator | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Linear moving stage | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Angle bracket, 90 degrees | Zaber | AB90M | Accessory of the linear moving stage |
| PMP forcep, 145 mm | Vitlab | 67995 | Nonmetallic tweezer |
| PTFE beaker, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | B2510MTH | |
| PCB cutter | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
| Nanoimprint device | Nanonex | NX-2000 | |
| Oxygen plasma generator | Femto Science | CUTE | |
| Low temperature sterilizer | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Confoal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM6701 | |
| Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
References
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
- Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
- Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
- Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101 (2017).
- Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
- Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
- Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
- Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
- Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
- Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
- Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
- Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
- Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394 (2012).
- Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
- Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
- Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632 (2017).
- Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
- Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
- Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
- Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466 (1995).
- Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126 (1996).
- Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
- Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
- Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).
