थर्मल Nanoimprinting तकनीक और मानव Endothelial कॉलोनी के गठन की प्रतिक्रिया की स्क्रीनिंग द्वारा ढाल Nanopattern के निर्माण कोशिकाओं
Summary
यहां, हम थर्मल nanoimprinting के माध्यम से ढाल nanopattern प्लेटों के निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है और nanostructures के लिए मानव endothelial जनक कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं स्क्रीनिंग की विधि । वर्णित प्रौद्योगिकी का उपयोग करके, यह एक पाड़ है कि शारीरिक उत्तेजनाओं से सेल व्यवहार में हेरफेर कर सकते है उत्पादन संभव है ।
Abstract
Nanotopography शरीर के आसपास विभिन्न extracellular मैट्रिक्स (ECMs) में पाया जा सकता है और सेलुलर प्रतिक्रियाओं पर महत्वपूर्ण नियामक कार्रवाई करने के लिए जाना जाता है । हालांकि, यह एक nanostructure के आकार और उचित जांच उपकरणों की कमी के कारण कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं के बीच संबंध निर्धारित करने के लिए मुश्किल है । यहां, हम सेलुलर प्रतिक्रियाओं के हेरफेर के लिए reproducible और लागत प्रभावी ढाल nanopattern प्लेटों के विकास को दिखाते हैं । एक मास्टर मोल्ड के रूप में anodic एल्यूमिनियम ऑक्साइड (ऐ) का प्रयोग, ढाल nanopattern प्लेटें बढ़ती व्यास पर्वतमाला के nanopillars के साथ [120-200 एनएम (जीपी 120/200), 200-280 एनएम (जीपी 200/280), और 280-360 एनएम (जीपी 280/360)] एक थर्मल प्रिंटिंग तकनीक द्वारा गढ़े थे । इन ढाल nanopattern प्लेटों को ECM में nanotopography के विभिंन आकारों की नकल डिजाइन किए थे और मानव endothelial कॉलोनी बनाने की कोशिकाओं (hECFCs) के प्रतिक्रियाओं स्क्रीन इस्तेमाल किया गया । इस प्रोटोकॉल में, हम सेल इंजीनियरिंग, मानव परिधीय रक्त से hECFCs की खेती की तकनीक, और nanopattern प्लेटों पर संवर्धन hECFCs के लिए ढाल nanopattern प्लेटों के निर्माण के कदम दर कदम प्रक्रिया का वर्णन ।
Introduction
हाल ही में, सतह स्थलाकृति के शारीरिक उत्तेजना द्वारा कोशिकाओं की प्रतिक्रिया सेल इंजीनियरिंग1,2,3,4के क्षेत्र में सुर्खियों में रहा है । इसलिए, अधिक ध्यान तीन-आयामी nanostructures पर कक्ष अनुलग्नक सरफ़ेस5पर ध्यान केंद्रित किया गया है । इसमें बताया गया है कि integrin, जो कोशिका की सतह पहचान यंत्र है, mechano-transduction६के माध्यम से ECM की सूक्ष्म नैनो संरचनाओं द्वारा संचालित भौतिक उत्तेजना को पहुंचाता है. इस यांत्रिक उत्तेजना से संपर्क मार्गदर्शन7 के माध्यम से सेल व्यवहार को नियंत्रित करता है और cytoskeletal पुनर्गठन के लिए आकार बदलने के लिए, फोकल आसंजन और कोशिकाओं की कठोरता के अलावा8।
शरीर में मानव endothelial जनक कोशिकाएं (hEPCs) बारीकी से microenvironment आसपास के ECM9के साथ बातचीत करते हैं । यह इंगित करता है कि ECM की शारीरिक स्थिति विशिष्ट कोशिका के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर के रूप में कार्य करता है-मैट्रिक्स आसंजन जटिल गठन के रूप में उतना कतरनी तनाव रक्त प्रवाह से व्युत्पंन10। यह सूचना दी है कि सतह nanotopography hEPCs11 के व्यापक केशिका ट्यूब नेटवर्क के इन विट्रो गठन को बढ़ाता है और एक ECM/जैव घुलनशील कारक प्रणाली संयुक्त सिस्टम सक्षम बनाता है hEPCs बेकार सब्सट्रेट पहचान करने के लिए और बढ़ावा देता है घाव भरने12,13. इसके बावजूद ECM और hEPCs के बीच संबंध स्पष्ट रूप से समझ में नहीं आ रहा है.
हालांकि कई शोधकर्ताओं ने सेल प्रतिक्रियाओं और विभिन्न सब्सट्रेट14,15,16से भौतिक संकेतों के बीच संबंध को स्पष्ट करने की कोशिश की, इन अध्ययनों से एक nanostructure के केवल निश्चित आकार का उपयोग किया या अनियमित व्यवस्था के साथ nanopatterns कि nanostructure और कोशिका व्यवहार के आकार के बीच संबंध स्पष्ट करने के लिए एक सीमा है । समस्या यहां सेलुलर प्रतिक्रियाओं कि मौजूदा थकाऊ और चलने दृष्टिकोण nanostructure के इष्टतम आकार को खोजने के लिए प्रतिस्थापित कर सकते है स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त उपकरणों की कमी है । इसलिए, एक सीधी तकनीक पुनरावृत्ति के बिना शारीरिक उत्तेजना पर सेल प्रतिक्रियाओं स्क्रीनिंग के लिए आवश्यक है ।
यहां, हम एक ढाल nanopattern जिसमें व्यवस्था की nanopillars का व्यास धीरे से बढ़ जाती है उत्पादन के लिए एक हमारी पिछली रिपोर्ट में इस्तेमाल किया विधि का वर्णन17,18,19 । इसके अलावा, हम यह भी बताया कि कैसे खेती और ढाल nanopattern प्लेटों पर hECFCs के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए कोशिकाओं पर शारीरिक उत्तेजनाओं के प्रभाव का निर्धारण । एक हल्के यांग, क्रमिक नक़्क़ाशी, और विरोधी परत कोटिंग विधि चिपके हुए ढाल ऐ मोल्ड निर्माण किया गया । एक थर्मल प्रिंटिंग लिथोग्राफी तकनीक अपनाने से, समान polystyrene ढाल nanopatterns एक लागत प्रभावी और सतही तरीके से उत्पादित किया गया । ग्रैडिएंट nanopatterns का उपयोग करना, यह निर्धारित करने के लिए संभव है कि nanostructure का कौन सा आकार प्रयोग के एक सेट में सेल व्यवहार पर एक महान प्रभाव है । हमें उंमीद है कि इस ढाल nanopattern रक्त व्युत्पंन hECFC या अंय कोशिकाओं और nanostructures के विभिंन आकारों के बीच बातचीत तंत्र को समझने में मददगार होगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक आओ के निर्माण अक्सर ऐसी दरारें के रूप में दोषों से ग्रस्त है, pores के अनियमित आकार, और जलती हुई । इन दोषों के लिए मुख्य कारण एक इलेक्ट्रोलाइटिक टूटने कहा जाता है, जो धातु सब्सट्रेट और इलेक्ट्रोलाइट<sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम द्वारा कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) द्वारा वित्त पोषित शिक्षा मंत्रालय, विज्ञान और प्रौद्योगिकी (MEST) [एनआरएफ-2015R1D1A1A01060397] और बायो एंड मेडिकल टेक्नोलॉजी डेवलपमेंट के माध्यम से किया गया था विज्ञान मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित एनआरएफ के कार्यक्रम, आईसीटी और भविष्य की योजना [एनआरएफ-2017M3A9C6029563].
Materials
| Perchloric acid 60% | Daejung Chemicals & Metals | 6512-4100 | |
| Ethyl alcohol, absolute 99.9% | Daejung Chemicals & Metals | 4118-4100 | |
| Phosphoric acid 85% | Daejung Chemicals & Metals | 6532-4400 | |
| Methyl alcohol 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 5558-4400 | |
| Chromium(VI) oxide | Daejung Chemicals & Metals | 2558-4400 | |
| Sulfuric acid 95% | Daejung Chemicals & Metals | 7781-4100 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Daejung Chemicals & Metals | 4104-4400 | |
| n-hexane 95% | Daejung Chemicals & Metals | 4081-4400 | |
| Toluene 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 8541-4400 | |
| (heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane | Gelest | SIH5840.4 | Moisture sensitive |
| Methoxynonafluorobutane 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| Collagen solution | Stemcell | #4902 | |
| Gelatin | Sigma aldrich | G1890 | Protein coating solution |
| Ficoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Hydrophilic polysaccharide solution |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Endothelial cell expansion medium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010031 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldehyde | Sigma aldrich | P6148 | |
| Glutaraldehyde | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Osmium tetroxide | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Octylphenol ethoxylate |
| Goat serum | Gibco | 26050-088 | |
| anti-human vinculin primary antibody | Sigma aldrich | V9131 | |
| F-actin probe | Molecular Probes | A12379 | Fluorescence-conjugated phalloidin |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A11001 | Fluorescence-conjugated secondary antibody |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Sigma aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Anti-human vWF primary antibody | DAKO | A0082 | |
| Anti-human CD144 primary antibody | BD Biosciences | #555661 | |
| Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA | Ted Pella | 18012 | Epoxy resin |
| Uranyl Acetate, 25g | Ted Pella | 19481 | |
| Lead Citrate, Trihydrate, 10g | Ted Pella | 19312 | |
| Ultra pure aluminum plate | Goodfellow | 26050-088 | |
| Polystyrene sheet | Goodfellow | ST313120 | |
| 8.0" silicon wafer | Siltron | 29-01024-03 | Single side polished, 725 µm thick |
| Vacuum desiccator, 4.4 L | Kartell | KA.230 | |
| Vacuum pump | Vacuumer | V3.VOP100 | |
| Power supply | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Magnetic stirrer | Daihan scientific | SL.SMS03022 | |
| Overhead stirrer | Daihan scientific | HT120DX | |
| Circulator | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Linear moving stage | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Angle bracket, 90 degrees | Zaber | AB90M | Accessory of the linear moving stage |
| PMP forcep, 145 mm | Vitlab | 67995 | Nonmetallic tweezer |
| PTFE beaker, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | B2510MTH | |
| PCB cutter | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
| Nanoimprint device | Nanonex | NX-2000 | |
| Oxygen plasma generator | Femto Science | CUTE | |
| Low temperature sterilizer | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Confoal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM6701 | |
| Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
References
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