Fabrikasjon av Gradient Nanopattern av termisk Nanoimprinting teknikk og Screening av responsen av menneskelig Colony-forming endotelceller
Summary
Her presenterer vi en protokoll for fabrikasjon av gradient nanopattern plater via termisk nanoimprinting og metode for screening svar av menneskelig endoteliale progenitor celler å nanostrukturer. Bruker den beskrevet teknologien, er det mulig å produsere et stillas som kan manipulere celle oppførsel ved fysisk stimuli.
Abstract
Nanotopography finnes i ulike ekstracellulære matriser (ECMs) rundt kroppen og er kjent for viktige forskrifter tiltak på mobilnettet reaksjoner. Det er imidlertid vanskelig å fastslå forholdet mellom størrelsen på en nanostructure og svar av celler på grunn av mangel på skikkelig screening verktøy. Her viser vi utviklingen av reproduserbar og kostnadseffektiv gradient nanopattern plater for manipulering av mobilnettet svar. Bruke anodic aluminiumoksid (AAO) som en master mold, gradient nanopattern plater med nanopillars av økende diameter områder [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) og 280-360 nm (GP 280/360)] ble fabrikkert av en termisk preging teknikk. Disse gradient nanopattern platene ble designet for å etterligne ulike størrelser på nanotopography i ECM og ble brukt til skjerm svarene på menneskelig colony-forming endotelceller (hECFCs). I denne protokollen beskriver vi fremgangsmåte å fabrikere gradient nanopattern plater for cellen engineering, teknikker dyrke hECFCs fra eksterne menneskeblod og dyrking hECFCs på nanopattern plater.
Introduction
Sist, responsen av celler av fysisk stimulering av form har vært profilert innen celle engineering1,2,3,4. Derfor har mer oppmerksomhet vært fokusert på tredimensjonale nanostrukturer på cellen vedlegg overflaten5. Det har blitt rapportert at integrin som er overflaten anerkjennelse enheten cellen, overfører fysiske stimulans drevet av mikro-nano strukturer av ECM gjennom mechano-signaltransduksjon6. Denne mekanisk stimulering regulerer celle atferd gjennom kontakt veiledning7 og induserer cellen cytoskjelett omorganisering skifte form, i tillegg til fokal adhesjon og stivhet av celler8.
Menneskelige endoteliale progenitor celler (hEPCs) i kroppen samhandle tett med microenvironment av omkringliggende ECM9. Dette angir at den fysiske tilstanden på ECM fungerer som en viktig parameter for bestemte cellen matrise vedheft komplekse formasjonen som skjæring stress avledet fra blodet flyt10. Det er rapportert at overflaten nanotopography forbedrer i vitro dannelsen av omfattende kapillarrør nettverk av hEPCs11 og at en ECM/bio løselig faktor kombinert systemet lar hEPCs å gjenkjenne dysfunksjonelle underlag og fremmer sår helbredelse12,13. Likevel, forholdet mellom ECM og hEPCs er ikke klart forstått.
Selv om mange forskere forsøkt å avklare forholdet mellom cellen svar og fysiske signaler fra forskjellige underlag14,15,16, disse studiene brukte bare fast størrelsen på en nanostructure eller nanopatterns med uregelmessig arrangementer som har en begrensning å belyse forholdet mellom størrelsen på nanostructure og celle virkemåten. Problemet her er mangel på egnet verktøy for screening mobilnettet svar som kan erstatte eksisterende kjedelig og repeterende tilnærminger for å finne den optimale størrelsen på nanostructure. En enkel teknikk er derfor nødvendig for screening celle reaksjoner på fysiske stimulations uten repetisjon.
Her beskriver vi en metode som brukes i våre tidligere rapporter17,18,19 for å produsere en gradient nanopattern der diameteren på den arrangert nanopillars gradvis øker. Dessuten, beskrevet vi også hvordan å dyrke og analysere atferden til hECFCs på gradient nanopattern plater å bestemme effekten av fysisk stimuli på cellene. En mild anodization, gradvis etsning og anti-stikker lag belegg metoden ble brukt til å dikte opp gradering AAO mold. Ved å vedta en termisk preging litografi teknikk, ble identiske polystyren gradient nanopatterns produsert i en kostnadseffektiv og lettvint måte. Bruke gradient nanopatterns, er det mulig å fastslå hvilke størrelse av nanostructure har stor innvirkning på celle atferd i ett sett av eksperimentet. Vi forventer at denne gradient nanopattern vil være nyttig i å forstå mekanismene som samspillet mellom blod-avledet hECFC eller andre celler og ulike størrelser av nanostrukturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fabrikasjon av en AAO ofte lider av defekter som sprekker, irregulær form av porene og brenning. Hovedårsaken til disse feilene kalles en elektrolytisk sammenbrudd, som er sterkt påvirket av typen metall substrater blir eloksert og resistivitet av elektrolytt21. Siden resistivitet av elektrolytt varierer avhengig av sin temperatur, er eliminere varme kontinuerlig fra elektrodene det kritiske punktet for beliggenhet temperaturen på elektrolytten stabil i en slik høy spenning anodiserings tilst…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av grunnleggende vitenskap forskningsprogrammet gjennom National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] og Bio- og medisinske teknologiutvikling Programmet for NRF finansiert av departementet for vitenskap, IKT og fremtid planlegger [NRF-2017M3A9C6029563].
Materials
| Perchloric acid 60% | Daejung Chemicals & Metals | 6512-4100 | |
| Ethyl alcohol, absolute 99.9% | Daejung Chemicals & Metals | 4118-4100 | |
| Phosphoric acid 85% | Daejung Chemicals & Metals | 6532-4400 | |
| Methyl alcohol 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 5558-4400 | |
| Chromium(VI) oxide | Daejung Chemicals & Metals | 2558-4400 | |
| Sulfuric acid 95% | Daejung Chemicals & Metals | 7781-4100 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Daejung Chemicals & Metals | 4104-4400 | |
| n-hexane 95% | Daejung Chemicals & Metals | 4081-4400 | |
| Toluene 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 8541-4400 | |
| (heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane | Gelest | SIH5840.4 | Moisture sensitive |
| Methoxynonafluorobutane 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| Collagen solution | Stemcell | #4902 | |
| Gelatin | Sigma aldrich | G1890 | Protein coating solution |
| Ficoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Hydrophilic polysaccharide solution |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Endothelial cell expansion medium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010031 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldehyde | Sigma aldrich | P6148 | |
| Glutaraldehyde | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Osmium tetroxide | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Octylphenol ethoxylate |
| Goat serum | Gibco | 26050-088 | |
| anti-human vinculin primary antibody | Sigma aldrich | V9131 | |
| F-actin probe | Molecular Probes | A12379 | Fluorescence-conjugated phalloidin |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A11001 | Fluorescence-conjugated secondary antibody |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Sigma aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Anti-human vWF primary antibody | DAKO | A0082 | |
| Anti-human CD144 primary antibody | BD Biosciences | #555661 | |
| Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA | Ted Pella | 18012 | Epoxy resin |
| Uranyl Acetate, 25g | Ted Pella | 19481 | |
| Lead Citrate, Trihydrate, 10g | Ted Pella | 19312 | |
| Ultra pure aluminum plate | Goodfellow | 26050-088 | |
| Polystyrene sheet | Goodfellow | ST313120 | |
| 8.0" silicon wafer | Siltron | 29-01024-03 | Single side polished, 725 µm thick |
| Vacuum desiccator, 4.4 L | Kartell | KA.230 | |
| Vacuum pump | Vacuumer | V3.VOP100 | |
| Power supply | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Magnetic stirrer | Daihan scientific | SL.SMS03022 | |
| Overhead stirrer | Daihan scientific | HT120DX | |
| Circulator | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Linear moving stage | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Angle bracket, 90 degrees | Zaber | AB90M | Accessory of the linear moving stage |
| PMP forcep, 145 mm | Vitlab | 67995 | Nonmetallic tweezer |
| PTFE beaker, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | B2510MTH | |
| PCB cutter | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
| Nanoimprint device | Nanonex | NX-2000 | |
| Oxygen plasma generator | Femto Science | CUTE | |
| Low temperature sterilizer | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Confoal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM6701 | |
| Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
References
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
- Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
- Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
- Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101 (2017).
- Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
- Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
- Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
- Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
- Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
- Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
- Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
- Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
- Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394 (2012).
- Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
- Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
- Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632 (2017).
- Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
- Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
- Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
- Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466 (1995).
- Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126 (1996).
- Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
- Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
- Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).
