Fabricação de gradiente Nanopattern pela técnica de Nanoimprinting térmica e rastreio da resposta das células formadoras endoteliais humanas
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a fabricação de placas de gradiente nanopattern através de nanoimprinting térmica e o método de triagem respostas de células progenitoras endoteliais humanas para as nanoestruturas. Usando a tecnologia descrita, é possível produzir um andaime que pode manipular o comportamento de célula por estímulos físicos.
Abstract
Nanotopography pode ser encontrado em várias matrizes extracelulares (ECMs) em torno do corpo e é conhecido por ter importantes acções regulamentares sobre reações celulares. No entanto, é difícil determinar a relação entre o tamanho de um nanostructure e as respostas das células devido à falta de ferramentas de triagem adequada. Aqui, nós mostramos o desenvolvimento de placas de nanopattern gradiente reprodutível e de baixo custo para a manipulação de respostas celulares. Usando o óxido de alumínio anódico (AAO) como um molde mestre, placas de gradiente nanopattern com nanopillars de intervalos de diâmetro crescente [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) e 280-360 nm (GP 280/360)] foram fabricados por uma térmica impressão técnica. Estas placas de gradiente nanopattern foram projetadas para imitar os vários tamanhos de nanotopography em ECM e foram usadas para a tela de respostas do humanas formadoras células endoteliais (hECFCs). Neste protocolo, descrevemos o procedimento passo a passo de fabricação de placas de gradiente nanopattern para celular, técnicas de cultivo hECFCs de sangue periférico humano e cultivo hECFCs em placas de nanopattern de engenharia.
Introduction
Recentemente, a resposta das células por estimulação física de topografia da superfície tem sido em destaque no campo da célula engenharia1,2,3,4. Portanto, mais atenção tem sido focada em nanoestruturas tridimensionais no celular acessório superfície5. Tem sido relatado que a integrina, que é o dispositivo de reconhecimento de superfície da célula, transmite o estímulo físico conduzido pelas estruturas micro-nano de ECM a transdução mechano6. Esta estimulação mecânica regula o comportamento da célula através de de orientação contato7 e induz a reorganização do citoesqueleto para mudar de forma, além de aderências focais e rigidez de células8.
Células progenitoras endoteliais humanas (hEPCs) no corpo interagem estreitamente com o microambiente do ECM circundante9. Isso indica que o estado físico de ECM atua como um parâmetro importante para a formação de complexos adesão célula-matriz específica como tensão de cisalhamento derivado de fluxo de sangue10. É relatado que nanotopography superfície aumenta a formação de redes de tubo capilar extensa de hEPCs11 em vitro e que um fator solúvel ECM/bio combinado sistema permite hEPCs reconhecer substratos disfuncionais e promove ferida cura12,13. No entanto, a relação entre ECM e hEPCs não é claramente entendida.
Embora muitos pesquisadores tentaram esclarecer a relação entre as respostas de célula e sinais físicos de diferentes substratos14,15,16, estes estudos usado apenas o tamanho fixo de um nanostructure ou nanopatterns com arranjos irregulares que possuem uma limitação para elucidar a relação entre o tamanho do comportamento nanostructure e celular. O problema é a falta de instrumentos adequados para a seleção de respostas celulares que podem substituir as abordagens existentes tediosas e iterativas para encontrar o tamanho ideal do nanostructure. Portanto, uma técnica simples é necessária para reações de célula em estímulos físicos sem repetição de triagem.
Aqui, descrevemos um método usado em nossos anteriores relatórios17,18,19 , para produzir um gradiente nanopattern em que o diâmetro da nanopillars arranjado aumenta gradualmente. Além disso, também descrevemos como cultivar e analisar o comportamento de hECFCs em placas de gradiente nanopattern para determinar o efeito de estímulos físicos sobre as células. Um suave anodização, gravura gradual e método de revestimento de camada decolagem foram usados para fabricar o molde AAO gradiente. Adotando uma térmica impressão técnica de litografia, nanopatterns gradientes poliestireno idênticos foram produzidas de forma econômica e fácil. Usando gradiente nanopatterns, é possível determinar qual o tamanho de nanostructure tem um grande efeito sobre o comportamento da célula em um conjunto de experiência. Esperamos que este gradiente nanopattern será útil na compreensão dos mecanismos de interação entre hECFC derivados de sangue ou outras células e vários tamanhos de nanoestruturas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fabricação de um AAO frequentemente sofre de defeitos tais como fissuras, formas irregulares de poros e queimando. A principal razão para esses defeitos é chamada uma repartição eletrolítica, que é fortemente afetada pela natureza das substratos metálicos sendo anodizado e a resistividade do eletrólito21. Desde que a resistividade do eletrólito varia de acordo com sua temperatura, eliminar o calor continuamente de eletrodos é o ponto crítico para manter a temperatura locacionais do el…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da educação, ciência e tecnologia (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] e Bio & desenvolvimento de tecnologia médica Programa da NRF financiado pelo Ministério da ciência, TIC & futuro planejamento [NRF-2017M3A9C6029563].
Materials
| Perchloric acid 60% | Daejung Chemicals & Metals | 6512-4100 | |
| Ethyl alcohol, absolute 99.9% | Daejung Chemicals & Metals | 4118-4100 | |
| Phosphoric acid 85% | Daejung Chemicals & Metals | 6532-4400 | |
| Methyl alcohol 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 5558-4400 | |
| Chromium(VI) oxide | Daejung Chemicals & Metals | 2558-4400 | |
| Sulfuric acid 95% | Daejung Chemicals & Metals | 7781-4100 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Daejung Chemicals & Metals | 4104-4400 | |
| n-hexane 95% | Daejung Chemicals & Metals | 4081-4400 | |
| Toluene 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 8541-4400 | |
| (heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane | Gelest | SIH5840.4 | Moisture sensitive |
| Methoxynonafluorobutane 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| Collagen solution | Stemcell | #4902 | |
| Gelatin | Sigma aldrich | G1890 | Protein coating solution |
| Ficoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Hydrophilic polysaccharide solution |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Endothelial cell expansion medium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010031 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldehyde | Sigma aldrich | P6148 | |
| Glutaraldehyde | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Osmium tetroxide | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Octylphenol ethoxylate |
| Goat serum | Gibco | 26050-088 | |
| anti-human vinculin primary antibody | Sigma aldrich | V9131 | |
| F-actin probe | Molecular Probes | A12379 | Fluorescence-conjugated phalloidin |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A11001 | Fluorescence-conjugated secondary antibody |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Sigma aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Anti-human vWF primary antibody | DAKO | A0082 | |
| Anti-human CD144 primary antibody | BD Biosciences | #555661 | |
| Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA | Ted Pella | 18012 | Epoxy resin |
| Uranyl Acetate, 25g | Ted Pella | 19481 | |
| Lead Citrate, Trihydrate, 10g | Ted Pella | 19312 | |
| Ultra pure aluminum plate | Goodfellow | 26050-088 | |
| Polystyrene sheet | Goodfellow | ST313120 | |
| 8.0" silicon wafer | Siltron | 29-01024-03 | Single side polished, 725 µm thick |
| Vacuum desiccator, 4.4 L | Kartell | KA.230 | |
| Vacuum pump | Vacuumer | V3.VOP100 | |
| Power supply | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Magnetic stirrer | Daihan scientific | SL.SMS03022 | |
| Overhead stirrer | Daihan scientific | HT120DX | |
| Circulator | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Linear moving stage | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Angle bracket, 90 degrees | Zaber | AB90M | Accessory of the linear moving stage |
| PMP forcep, 145 mm | Vitlab | 67995 | Nonmetallic tweezer |
| PTFE beaker, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | B2510MTH | |
| PCB cutter | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
| Nanoimprint device | Nanonex | NX-2000 | |
| Oxygen plasma generator | Femto Science | CUTE | |
| Low temperature sterilizer | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Confoal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM6701 | |
| Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
References
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
- Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
- Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
- Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101 (2017).
- Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
- Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
- Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
- Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
- Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
- Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
- Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
- Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
- Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394 (2012).
- Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
- Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
- Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632 (2017).
- Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
- Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
- Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
- Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466 (1995).
- Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126 (1996).
- Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
- Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
- Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).
