Здесь мы представляем протокол для изготовления пластин градиента nanopattern через тепловые nanoimprinting и метод скрининга ответы клеток человека эндотелиальной прародитель наноструктур. С помощью описанных технологий, можно производить эшафот, что можно управлять поведение клеток, физические раздражители.
Нанотопографии могут быть найдены в различных внеклеточной матрицы (ECMs) вокруг тела и как известно, имеют важные регламентационных на клеточных реакций. Однако трудно определить связь между размером наноструктур и реакции клеток из-за отсутствия надлежащей проверки инструментов. Здесь мы покажем развития воспроизводимых и экономически градиента nanopattern пластин для манипуляции клеточных реакций. Использование анодного оксида алюминия (ААО) в качестве главной формы, градиент nanopattern плиты с nanopillars хребтов увеличения диаметра [120-200 Нм (GP 120/200), 200-280 Нм (GP 200/280) и 280-360 Нм (GP 280/360)] были сфабрикованы тепловой импринтинга технику. Эти пластины градиента nanopattern были разработаны для имитации различных размеров нанотопографии в ECM и были использованы для экран ответов человека эндотелиальных образуя колонии клеток (hECFCs). В этом протоколе опишем шаг за шагом процедура изготовления градиента nanopattern пластины для ячейки, инженерия, технологии выращивания hECFCs из периферической крови человека и культивирования hECFCs на nanopattern пластины.
Недавно реакция клеток по физической стимуляции топографии поверхности была освещена в поле ячейки инженерных1,2,3,4. Таким образом больше внимания было уделено трехмерной наноструктур на поверхности клеток вложений5. Сообщается, что Интегрин, который является устройством поверхности признание ячейки, передает физический раздражитель, управляемый микро нано составами ECM-механо трансдукция6. Это механическая стимуляция регулирует поведение клеток через контакт руководство7 и индуцирует цитоскелета реорганизации менять форму, помимо координационных спаек и жесткость8клеток.
Человека эндотелиальной прародитель клеток (hEPCs) в организме тесно взаимодействуют с микроокружения окружающих ECM9. Это означает, что физическое состояние ECM действует как важный параметр для конкретных ячеек матрица адгезии комплекс формирования как касательное напряжение, полученных из крови поток10. Сообщается, что поверхности нанотопографии повышает в vitro создание сетей обширной капиллярной трубки hEPCs11 и растворимых факторов ECM/био комбинированная система позволяет hEPCs признать неблагополучных субстратов и способствует ранение исцеления12,13. Тем не менее отношения между ECM и hEPCs не четко понимать.
Хотя многие исследователи пытались прояснить взаимосвязь между клеток ответов и физические сигналы от различных субстратов14,,1516, эти исследования используются только фиксированный размер наноструктурированных или nanopatterns с неправомерных механизмов, которые имеют ограничение для прояснения взаимосвязи между размер поведения наноструктур и клеток. Проблема здесь является отсутствие подходящих инструментов для скрининга клеточных реакций, которые могут заменить существующие утомительной и итеративный подходы к найти оптимальный размер наноструктур. Таким образом простой метод не требуется для скрининга реакциях на физической стимуляции без повторения.
Здесь мы описываем метод, используемый в наших предыдущих докладов17,18,19 производить градиента nanopattern, в котором постепенно увеличивается диаметр аранжированное nanopillars. Кроме того мы также описал, как обрабатывать и анализировать поведение hECFCs на градиент nanopattern пластины для определения влияния физических раздражителей на клетки. Мягкий анодирование, постепенно травления и против прилипания слой покрытия методом были использованы для изготовления градиента ААО плесень. Приняв тепловой импринтинга технике литографии, идентичные полистирола градиента nanopatterns были произведены в экономически эффективным и легким способом. Использование градиента nanopatterns, представляется возможным определить, какой размер наноструктурированных имеет большое влияние на поведение ячейки в одном наборе эксперимента. Мы ожидаем, что этот градиент nanopattern будет полезным для понимания механизмов взаимодействия между крови производные hECFC или другие клетки и различных размеров наноструктур.
Изготовление AAO часто страдает от такие дефекты, как трещины, неправильной формы поры, и горения. Основная причина этих дефектов называется электролитической пробоя, которая сильно зависит от характера металлические субстраты анодированный и сопротивление электролита21. ?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана базовой программы исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством образования, науки и технологии (MEST) [СР 2015R1D1A1A01060397] и био и медицинской технологии развития Программа финансируется министерством науки, ИКТ и будущего планирования [СР 2017M3A9C6029563] СР НАТО.
Perchloric acid 60% | Daejung Chemicals & Metals | 6512-4100 | |
Ethyl alcohol, absolute 99.9% | Daejung Chemicals & Metals | 4118-4100 | |
Phosphoric acid 85% | Daejung Chemicals & Metals | 6532-4400 | |
Methyl alcohol 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 5558-4400 | |
Chromium(VI) oxide | Daejung Chemicals & Metals | 2558-4400 | |
Sulfuric acid 95% | Daejung Chemicals & Metals | 7781-4100 | |
Hydrogen peroxide 30% | Daejung Chemicals & Metals | 4104-4400 | |
n-hexane 95% | Daejung Chemicals & Metals | 4081-4400 | |
Toluene 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 8541-4400 | |
(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane | Gelest | SIH5840.4 | Moisture sensitive |
Methoxynonafluorobutane 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
Collagen solution | Stemcell | #4902 | |
Gelatin | Sigma aldrich | G1890 | Protein coating solution |
Ficoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Hydrophilic polysaccharide solution |
EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Endothelial cell expansion medium |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline | Gibco | 10010031 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
Paraformaldehyde | Sigma aldrich | P6148 | |
Glutaraldehyde | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
Osmium tetroxide | Sigma aldrich | 201030-1G | |
Hexamethyldisilazane | Sigma aldrich | 440191 | |
Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Octylphenol ethoxylate |
Goat serum | Gibco | 26050-088 | |
anti-human vinculin primary antibody | Sigma aldrich | V9131 | |
F-actin probe | Molecular Probes | A12379 | Fluorescence-conjugated phalloidin |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A11001 | Fluorescence-conjugated secondary antibody |
4',6-diamidino-2-phenylindole | Sigma aldrich | D9542 | |
Mounting medium | DAKO | S3023 | |
Anti-human vWF primary antibody | DAKO | A0082 | |
Anti-human CD144 primary antibody | BD Biosciences | #555661 | |
Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA | Ted Pella | 18012 | Epoxy resin |
Uranyl Acetate, 25g | Ted Pella | 19481 | |
Lead Citrate, Trihydrate, 10g | Ted Pella | 19312 | |
Ultra pure aluminum plate | Goodfellow | 26050-088 | |
Polystyrene sheet | Goodfellow | ST313120 | |
8.0" silicon wafer | Siltron | 29-01024-03 | Single side polished, 725 µm thick |
Vacuum desiccator, 4.4 L | Kartell | KA.230 | |
Vacuum pump | Vacuumer | V3.VOP100 | |
Power supply | Unicorntech | UDP-3003 | |
Magnetic stirrer | Daihan scientific | SL.SMS03022 | |
Overhead stirrer | Daihan scientific | HT120DX | |
Circulator | Daihan scientific | WCR-P12 | |
Linear moving stage | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
Angle bracket, 90 degrees | Zaber | AB90M | Accessory of the linear moving stage |
PMP forcep, 145 mm | Vitlab | 67995 | Nonmetallic tweezer |
PTFE beaker, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
Ultrasonic cleaner | Branson | B2510MTH | |
PCB cutter | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
Nanoimprint device | Nanonex | NX-2000 | |
Oxygen plasma generator | Femto Science | CUTE | |
Low temperature sterilizer | Lowtem | Crystal 50 | |
CO2 Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
Confoal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
Scanning electron microscope | JEOL | JSM6701 | |
Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |