מערך Glycan המודפס: טכניקה רגישה לניתוח של הרפרטואר של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות בבעלי חיים קטנים
Summary
עבודה זו מציגה את הפוטנציאל של טכנולוגיית מערך (PGA) glycan המודפס על הניתוח של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות בבעלי חיים קטנים.
Abstract
הרפרטואר של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות של אדם נתון קשורה לעיתים קרובות עם מעמדה אימונולוגי. לא רק תנאי המערכת החיסונית בודדים קובע את ההצלחה במאבק פנימי וחיצוני אותות איום פוטנציאלי, אלא גם קיומו של דפוס מסוים של מחזורי נוגדנים anti-glycan (וגם וריאציה רמת סרולוגית שלהם) יכול להיות סמן משמעותי של התפתחות, התקדמות של מצבים פתולוגיים מסוימים. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה מבוססת-מודפס Glycan מערך PGA מציעה את ההזדמנות כדי למדוד מאות מטרות glycan עם רגישות גבוהה מאוד; באמצעות כמות מזערית של מדגם, אשר בעלי חיים נוכח בעת קטנות הגבלת נפוצות (חולדות, עכברים, אוגר, וכו ‘) משמשים כמודלים להיבטים כתובת של מחלות אנושיות. דוגמה מייצגת של גישה זו, אנו מראים את התוצאות שהתקבלו הניתוח של הרפרטואר של נוגדנים אנטי טבעי-glycan בעכברים BALB/c. נדגים כי כל עכבר BALB/c מעורב במחקר, למרות להיות זהים גנטית ומתוחזק תחת באותם התנאים, מפתחת דפוס מסוים של נוגדנים אנטי-פחמימות טבעי. עבודה זו טוענת להרחיב את השימוש בטכנולוגיה PGA לחקור רפרטואר (specificities) ואת רמות ומגבלותיהם נוגדנים אנטי-פחמימות, בריאות והן במהלך כל מצב פתולוגי.
Introduction
נוגדנים לשחק תפקיד מרכזי בהגנה שלנו נגד פולשים גורמי מחלה על ידי ישירות לנטרל וירוסים1,2 ו חיידקים2,3, על ידי הפעלת המשלים מערכת4,5 השיפור של phagocytosis6. בנוסף, הם מרכיבים חיוניים סרטן מיקוד, חיסול של תאים ממאירים7, והומאוסטזיס תחזוקה8,9.
הפרעות של מערכת החיסון יכול לגרום מחלות אוטואימוניות דלקתיות10 וסרטן11. כל התנאים פתולוגיים אידיאלי דורשים אבחנה בקשה לטיפול יעיל. במקרה של הפרעות אוטואימוניות, נוכחות סרולוגית עצמיים ברוב המקרים הוא מנבא על אבחון של מחלת חיסון עצמי10,12. נוגדנים אלה מגיבים עם פני השטח של התא, autoantigens חוץ-תאית, והם לעיתים קרובות קיים במשך שנים רבות לפני המצגת של מחלות אוטואימוניות10,12. ליקויים החיסונית וסרטן מאובחנים גם עם בדיקות דם גם למדוד את רמת מרכיבי מערכת החיסון כגון נוגדנים, או שלהם פעילות פונקציונלית11.
הזיהוי של הרפרטואר של מחזורי נוגדנים ורמות סרולוגית שלהם הם הכרחיים כדי לקבוע פרוגנוזה וכדי להעריך את ההתקדמות של כל התנאים שהוזכרו פתולוגי. בעבר הראו את הפוטנציאל של PGA טכניקת הניתוח של מחזורי נוגדנים מיני בעלי חיים שונים13–16, צמצום כמויות גדולות של דגימות סרולוגית, מתחמק מהבעיה הקשורים נוגדנים אשיג17 ו תפוקה גבוהה המאפשר פרופיל של רפרטואר נרחב של נוגדנים15.
מבוסס-Glycan immunoassays הם בעיקר מותנה, בין היתר, מקור וייצור של פחמימות, הקובעות את הזיקה ואיגוד של ליגנדים15,18,19,20 ,21. ניתן לפתח immunoassays Glycan מבוססי ההשעיה (microspheres)15,21,22 או משטחים מופעל שטוח15,21,22, 23,24. האחרון נמנים אליסה (המקובל ביותר של שיטות אלה) PGA. אין הרבה נתונים השוואת מתודולוגיות אלה אותה הגדרה ניסיוני15,25,26,27. בעבר השווינו את היעילות ואת מידת הבררנות של אלה immunoassays על פרופיל נוגדנים anti-glycan דוגמאות בודדות לפלסמה אנושית15. נוגדנים מסוימים כגון אלה מיקוד סוג הדם anti-A/B, כל immunoassays יכולה לזהות אותם עם מובהקות סטטיסטית, הם בקורלציה חיובית עם השני15,18,21. בינתיים, נוגדנים anti-P1 אותרו בעיקר על ידי PGA עם הכוח שמסווגת הגבוה ביותר, ולא היה שום קורלציה ב האישושים שנעשו על ידי15,immunoassays שונים מבוססי glycan18, 21. ההבדלים בין השיטות שהיו קשורים בעיקר אנטיגן נוגדן/יחס ואת glycan התמצאות15. אליסה ומתלים מערכים רגישים יותר מחייב לא ספציפי יותר PGA כי יש עודף של אנטיגן על נוגדנים אלה שיטות15. בנוסף, כיוון glycans ב PGA הוא מוגבל יותר מאשר מערכים של אליסה ומתלים –15. אליסה נוח כאשר המחקר כולל פאנל מוגבלת של glycans. מערכים ההשעיה, אליסה מציע גמישות רחבה יותר לגבי שינוי תצורה וזמינותו. PGA נוח במיוחד עבור גילוי גישות15,18,21,28. למרות ברור יתרונות וחסרונות אלה, immunoassays שהוזכרו שלוש יכול לשמש כדי לחקור היבטים שונים של אינטראקציות glycan-נוגדן. המטרה הסופית של המחקר הוא שאחד ינחה את הבחירה של המתודולוגיה מתאימה יותר.
ההווה פועלים שואפת להרחיב את השימוש בטכנולוגיה PGA לניתוח של הרפרטואר של מחזורי נוגדני anti-glycan חיות קטנות. כתוצאה מכך נציג, אנו מציגים כאן פרוטוקול נתונים היסטוריים כדי להעריך את הרפרטואר של נוגדנים אנטי-פחמימות טבעי בעכברים BALB/c למבוגרים מאת PGA.
Protocol
Representative Results
Discussion
מיקרו-מערכים Glycan הפכו להיות כלי הכרחי לימוד אינטראקציות חלבון-glycan40. העבודה הנוכחית מתאר פרוטוקול מבוסס על טכנולוגיית PGA ללמוד את הרפרטואר של מחזורי של נוגדנים אנטי-פחמימות בעכברים BALB/c. מאז PGA מציעה את האפשרות מסך לכמויות גדולות של glycans ביולוגית לא ידוע, זה גילוי נוח במיוחד כלי<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי “Fondo דה Investigaciones Sanitarias” (FIS) מענק PI13/01098 של קרלוס השלישי מכון בריאות, משרד הבריאות הספרדי. DB-G היה נהנו ממיקום מחקר פוסט דוקטורט במימון האיחוד האירופי תכנית המסגרת השביעית (האיחוד FP7/2007-2013) תחת גרנט הסכם 603049 (TRANSLINK). עבודתו של NK, NS, ו NB נתמך על ידי מענק #14-50-00131 של קרן המדע הרוסי. DB-G רוצה להביע את תודתי מרתה מתפוצץ, ג’יי פבלו סלבדור אנה Sanchis לסיוע טכני מעולה ושל אלכסנדר Rakitko לקבלת סיוע בניתוח סטטיסטי. עם התמיכה של “פלה דה Doctorats Industrials de la Secretaria d’Universitats אני Recerca דל Departament d’Empresa אני Coneixement de la Generalitat דה קטלוניה (להעניק מספר 2018 DI 021). אנו מודים סרקא תכנית / Generalitat דה קטלוניה לתמיכה מוסדית.
Materials
| Antibodies | |||
| biotinylated goat anti-human Igs | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Ref. #: 31782 | |
| biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: 31807 | |
| Equipment | |||
| Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5 | Scienion AG, Berlin, Germany | http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/ | |
| Stain Tray (slide incubation chamber) | Simport, Beloeil, QC, Canada | Ref. #: M920-2 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | Ref. #: 5810 R | |
| Pipettes | Gilson, Middleton, WI, USA | http://www.gilson.com/en/Pipette/ | |
| Slide Scanner | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | ScanArray GX Plus | |
| Shaking incubator | Cole-Parmer, Staffordshire, UK | Ref. #: SI50 | |
| Biological samples | |||
| BALB/c mice sera | This paper | N/ A | |
| Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) | Immuno-Gem, Moscow, Russia | http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531 | |
| Chemicals, Reagents and Glycans | |||
| Glycan library | Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia | N/ A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, | Ref. #: A9418 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | Ref. #: 411000 | |
| Tween-20 | Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain | Ref. #: 655204 | |
| Phospahte buffered saline (PBS) | VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain | Ref. #: E404 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Ref. #: S2002 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: S21381 | |
| Streptavidin Cy5 conjugate | GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK | Ref. #: PA45001 | |
| Materials | |||
| N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H | Schott-Nexterion, Jena, Germany | Ref. #: 1070936 | |
| Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | Ref. #: WHA10347509 | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Ref. #: 0030120086 | |
| Software and algorithms | |||
| ScanArray Express Microarray Analysis System | PerkinElmer | http://www.per | |
| kinelmer.com/microarray | |||
| Hierarchical Clustering Explorer application | University of Maryland, MD, USA | http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/ | |
References
- Karlsson, G. B., Fouchier, R. A., Phogat, S., Burton, D. R., Sodroski, J., Wyatt, R. T. The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus. Nat Rev Microbiol. 6 (2), 143-155 (2008).
- Lu, L. L., Suscovich, T. J., Fortune, S. M., Alter, G. Beyond binding: antibody effector functions in infectious diseases. Nat Rev Immunol. 18 (1), 46-61 (2017).
- Bebbington, C., Yarranton, G. Antibodies for the treatment of bacterial infections: current experience and future prospects. Curr Opin Biotech. 19 (6), 613-619 (2008).
- Murphy, K., Travers, P., Walport, M. The complement system and innate immunity. Janeway’s Immunobiology. , 61-80 (2008).
- Botto, M., Kirschfink, M., Macor, P., Pickering, M. C., Wurzner, R., Tedesco, F. Complement in human diseases: lessons from complement deficiencies. Mol Immunol. 46 (14), 2774-2783 (2009).
- Borrok, M. J., et al. Enhancement of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by endowing IgG with FcαRI (CD89) binding. MAbs. 7 (4), 743-751 (2015).
- Weiner, L. M., Murray, J. C., Shuptrine, C. W. Antibody-based immunotherapy of cancer. Cell. 148 (6), 1081-1084 (2012).
- Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nat Immunol. 11 (9), 785-797 (2010).
- Prechl, J. A generalized quantitative antibody homeostasis model: antigen saturation, natural antibodies and a quantitative antibody network. Clin Transl Immunology. 6 (2), e131 (2017).
- Vojdani, A. Antibodies as predictors of complex autoimmune diseases. Int J Immunopath Ph. 21 (2), 267-278 (2008).
- Liu, W., Peng, B., Lu, Y., Xu, W., Qian, W., Zhang, J. Y. Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis. Autoimmun Rev. 10 (6), 331-335 (2011).
- Suurmond, J., Diamond, B. Autoantibodies in systemic autoimmune diseases: specificity and pathogenicity. J Clin Invest. 125 (6), 2194-2202 (2015).
- Bovin, N., et al. Repertoire of human natural anti-glycan immunoglobulins. Do we have auto-antibodies?. Biochim Biophys Acta. 1820 (9), 1373-1382 (2012).
- de los Rios, M., Criscitiello, M. F., Smider, V. V. Structural and genetic diversity in antibody repertoires from diverse species. Curr Opin Struc Biol. 33, 27-41 (2015).
- Pochechueva, T., et al. Comparison of printed glycan array, suspension array and ELISA in the detection of human anti-glycan antibodies. Glycoconjugate J. 28 (8-9), 507-517 (2011).
- Shilova, N., Navakouski, M., Khasbiullina, N., Blixt, O., Bovin, N. Printed glycan array: antibodies as probed in undiluted serum and effects of dilution. Glycoconjugate J. 29 (2-3), 87-91 (2012).
- Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17C-23C (2007).
- Jacob, F., et al. Serum anti-glycan antibody detection of non-mucinous ovarian cancers by using a printed glycan array. Int. J. Cancer. 130 (1), 138-146 (2012).
- Lewallen, D. M., Siler, D., Iyer, S. S. Factors affecting protein-glycan specificity: effect of spacers and incubation time. ChemBioChem. 10 (9), 1486-1489 (2009).
- Oyelaran, O., Li, Q., Farnsworth, D., Gildersleeve, J. C. Microarrays with varying carbohydrate density reveal distinct subpopulations of serum antibodies. J. Proteome Res. 8 (7), 3529-3538 (2009).
- Pochechueva, T. Multiplex suspension array for human anti-carbohydrate antibody profiling. Analyst. 136 (3), 560-569 (2011).
- Chinarev, A. A., Galanina, O. E., Bovin, N. V. Biotinylated multivalent glycoconjugates for surface coating. Methods Mol Biol. 600, 67-78 (2010).
- Huflejt, M. E. Anti-carbohydrate antibodies of normal sera: findings, surprises and challenges. Mol Immunol. 46 (15), 3037-3049 (2009).
- Buchs, J. P., Nydegger, U. E. Development of an ABO-ELISA for the quantitation of human blood group anti-A and anti-B IgM and IgG antibodies. J Immunol Methods. 118 (1), 37-46 (1989).
- de Jager, W., Rijkers, G. T. Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: a comparison. Methods. 38 (4), 294-303 (2006).
- Galanina, O. E., Mecklenburg, M., Nifantiev, N. E., Pazynina, G. V., Bovin, N. V. GlycoChip: multiarray for the study of carbohydrate binding proteins. Lab Chip. 3 (4), 260-265 (2003).
- Willats, W. G., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: a novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
- Bello-Gil, D., Khasbiullina, N., Shilova, N., Bovin, N., Mañez, R. Repertoire of BALB/c mice natural anti-Carbohydrate antibodies: mice vs. humans difference, and otherness of individual animals. Front Immunol. 8, 1449 (2017).
- Pazynina, G., et al. Synthetic glyco-O-sulfatome for profiling of human natural antibodies. Carbohydr Res. 445, 23-31 (2017).
- Ryzhov, I. M., Korchagina, E. Y., Popova, I. S., Tyrtysh, T. V., Paramonov, A. S., Bovin, N. V. Block synthesis of A (type 2) and B (type 2) tetrasaccharides related to the human ABO blood group system. Carbohydr Res. 430, 59-71 (2016).
- Ryzhov, I. M., et al. Function-spacer-lipid constructs of Lewis and chimeric Lewis/ABH glycans. Synthesis and use in serological studies. Carbohyd Res. 435, 83-96 (2016).
- Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Tuzikov, A. B., Bovin, N. V. Stereo- and regio-selective synthesis of spacer armed α2-6 sialooligosaccharides. Mendeleev Commun. 26 (5), 380-382 (2016).
- Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Formanovsky, A. A., Bovin, N. V. Synthesis of blood group pentasaccharides ALey, BLey and related tri- and tetrasaccharides. Mendeleev Commun. 26 (2), 103-105 (2016).
- Severov, V. V., Pazynina, G. V., Ovchinnikova, T. V., Bovin, N. V. The synthesis of oligosaccharides containing internal and terminal Galβ1-3GlcNAcβ fragments. Russian J. Bioorgan. Chem. 41 (2), 147-160 (2015).
- Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Bovin, N. V. Synthesis of glycoprotein N-chain core fragment GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc. Mendeleev Commun. 25 (4), 250-251 (2015).
- Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
- Pazynina, G. V., et al. Divergent strategy for the synthesis of α2-3-Linked sialo-oligosaccharide libraries using a Neu5TFA-(α2-3)-Gal building block. Synlett. 24 (02), 226-230 (2013).
- Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. P Natl Acad Sci USA. 101 (49), 17033-17038 (2004).
- Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. 27 (4), 280-284 (2017).
- Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Cummings, R. D., Smith, D. F. Chemistry of natural glycan microarrays. Curr Opin Chem Biol. 18, 70-77 (2014).
- Hoy, Y. E., et al. Variation in taxonomic composition of the fecal microbiota in an inbred mouse strain across individuals and time. PLoS One. 10 (11), e0142825 (2015).
- D’Argenio, V., Salvatore, F. The role of the gut microbiome in the healthy adult status. Clin Chim Acta. 451 (Pt A), 97-102 (2015).
- Khasbiullina, N. R., Bovin, N. V. Hypotheses of the origin of natural antibodies: a glycobiologist’s opinion. Biochemistry (Mosc). 80 (7), 820-835 (2015).
- Butler, J. E., Sun, J., Weber, P., Navarro, P., Francis, D. Antibody repertoire development in fetal and newborn piglets, III. Colonization of the gastrointestinal tract selectively diversifies the preimmune repertoire in mucosal lymphoid tissues. Immunology. 100 (1), 119-130 (2000).
- Bos, N. A., et al. Serum immunoglobulin levels and naturally occurring antibodies against carbohydrate antigens in germ-free BALB/c mice fed chemically defined ultrafiltered diet. Eur J Immunol. 19 (12), 2335-2339 (1980).
- van der Heijden, P. J., Bianchi, A. T., Heidt, P. J., Stok, W., Bokhout, B. A. Background (spontaneous) immunoglobulin production in the murine small intestine before and after weaning. J Reprod Immunol. 15 (3), 217-227 (1989).
- Krasnova, L., Wong, C. H. Understanding the chemistry and biology of glycosylation with glycan synthesis. Annu Rev Biochem. 85, 599-630 (2016).
- Overkleeft, H. S., Seeberger, P. H., Varki, A. Chemoenzymatic synthesis of glycans and glycoconjugates. Essentials of Glycobiology [Internet]. , 2015-2017 (2017).
