인쇄 Glycan 배열: 작은 동물에 반대로 탄수화물 항 체 순환의 레 퍼 토리의 분석에 대 한 민감한 기술
Summary
이 작은 동물에 반대로 탄수화물 항 체 순환의 분석에 대 한 인쇄 glycan 배열 (PGA) 기술의 잠재력을 보여줍니다.
Abstract
주어진된 개인의 반대로 탄수화물 항 체 순환의 레 퍼 토리는 종종 면역 상태와 연결 됩니다. 뿐만 아니라 개별 면역 상태 결정 내부 및 외부 잠재적인 위협 신호를 퇴치에 성공 하지만 순환 안티 glycan 항 체 (및 그들의 혈 청 학적인 수준 변화)의 특정 패턴의 존재도 될 수는 발병과 병 적인 특정 조건의 진행의 중요 한 표식입니다. 여기, 우리는 매우 높은 감도; glycan 목표의 수백을 측정 하는 기회를 제공 하는 인쇄 Glycan 배열 PGA 기반 방법론 설명 샘플은 일반적인 제한 때 작은 동물의 최소 금액을 사용 하 여 (쥐, 쥐, 햄스터 등) 주소 측면 인간의 질병의 모델로 사용 됩니다. 이 방법의 대표적인 예를 들어, 우리는 자연 안티 glycan BALB/c 마우스에 항 체의 레 퍼 토리의 분석에서 얻은 결과 보여줍니다. 우리는 유전으로 동일 하 고 동일한 조건 하에서 유지 되 고에도 불구 하 고 연구에 참여 각 BALB/c 마우스 자연 안티 탄수화물 항 체의 특정 패턴을 개발 보여줍니다. 이 작품을 레 퍼 토리 (특이성) 조사 PGA 기술의 사용과 반대로 탄수화물 항 체, 건강에 어떤 병 적인 상태와 순환의 수준을 확장 하 주장 한다.
Introduction
항 체는 직접 보완 시스템4,5 를 활성화 하 여 바이러스1,2 , 박테리아2,3, 중화 하 여 병원 균 침입에 대 한 우리의 방어에 중심 역할을 담당 그리고 먹어서6의 향상입니다. 또한, 그들은 암 타겟팅 및 악성 세포7및 항상성 유지 보수8,9의 제거에 필수적인 요소입니다.
면역 시스템의 장애 자가 면역 및 염증 성 질환 및 암10 11발생할 수 있습니다. 이러한 병 적인 조건을 이상적으로 효율적인 치료에 대 한 신속한 진단 요구. 자가 면역 질환의 경우 대부분의 경우에는 신경의 혈 청 학적인 존재 면역10,12의 진단에 대 한 예측 이다. 이 항 체 세포 표면으로 반작용 하 고 extracellular autoantigens, 그들은 종종 면역 질환10,12의 프레 젠 테이 션을 하기 전에 몇 년 동안 존재. 면역 결핍증과 암은 또한으로 진단 혈액 검사도 항 체, 또는 그들의 기능 활동11같은 면역 요소의 수준을 측정.
순환 항 체 및 그들의 혈 청 학적인 레벨의 레 퍼 토리의 식별은 설정 하는 예 지 고 언급 한 병 적인 상황의 진행 평가 답해야 합니다. 우리는 이전 증명 하고있다 다른 동물 종13–16, 항 체 순환의 분석을 위한 PGA 기술의 잠재력 문제를 피하고 serological 샘플의 큰 볼륨의 사용을 최소화 연관 된 항 체 분17 및 수 있도록 높은 처리량 항 체15의 광범위 한 레 퍼 토리의 프로 파일링.
Glycan 기반 immunoassays는 주로 단련, 다른 요인 중 기원과 탄수화물, 선호도 및 ligands15,,1819,20 의 바인딩 결정 하는의 생산에 의해 21. Glycan 기반 immunoassays 정지 (스피어)15,,2122 또는 평면 활성화 표면15,,2122, 개발 될 수 있다 23,24. 마지막 (가장 평범한 이러한 메서드의) ELISA 등 PGA. 데이터는 동일한 실험 설정15,25,,2627에 이러한 방법론을 비교 하지 않습니다. 우리는 이전 효능과 선택도 이러한 immunoassays 개별 인간의 플라즈마 샘플15프로필 안티 glycan 항 체의 비교 했습니다. 그 대상으로 안티-A/B 혈액 그룹 등 일부 항 체에 대 한 모든 immunoassays 통계적 의미와 그들을 감지할 수 있는 그리고 그들은 적극적으로 서로 서로15,,1821. 한편, 안티-P1 항 체 주로 구별 고성능 PGA에 의해 발견 했다 하 고 다른 glycan 기반 immunoassays15,18, 에 의해 만들어진 결정에 상관 관계가 없었다 21. 방법 사이의 이러한 차이 주로 항 체/항 원 비율 및 glycan 방향15관련이 있었다. ELISA 및 서 스 펜 션 배열을 이러한 방법을15항 체에 항 원의 과잉 때문에 PGA 보다 불특정 바인딩을 더 따르게 됩니다. 또한, 미국 PGA에서 glycans의 방향을 ELISA와 서 스 펜 션 배열15보다 더 제한 됩니다. ELISA는 연구 glycans의 제한 된 패널을 포함 하는 경우에 편리 합니다. 서 스 펜 션 배열 함께 ELISA 분석 결과 재구성에 관한 광범위 한 유연성을 제공합니다. PGA는 발견 접근15,18,,2128매우 편리 합니다. 이러한 명확한 장점과 단점에도 불구 하 고 3 개의 언급된 immunoassays glycan 항 체 상호 작용의 다양 한 측면을 연구 사용 수 있습니다. 연구의 최종 목표는 하나 더 적합 한 방법론의 선택을 안내할 것입니다.
현재 작동 작은 동물 항 체 안티 glycan 순환의 레 퍼 토리의 분석을 위한 PGA 기술을 사용 하 여 확장 하는 것을 목표로 합니다. 대표 결과적으로 선물이 여기 PGA에 의해 성인 BALB/c 마우스에서 자연 안티 탄수화물 항 체의 레 퍼 토리를 평가 하기 위해 상세한 프로토콜.
Protocol
Representative Results
Discussion
Glycan microarrays 단백질 glycan 상호 작용40공부에 대 한 필수적인 도구가 되고있다. 현재 일 PGA BALB/c 마우스 항 체 항 탄수화물의 순환의 레 퍼 토리를 연구 기술을 기반으로 하는 프로토콜을 설명 합니다. PGA 스크린 다 수 알 수 없는 생물학 glycans의 가능성을 제공 합니다, 이후 그것은 매우 편리한 검색 도구13,15,28</sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 “Fondo 드 Investigaciones Sanitarias”에 의해 지원 되었다 (FIS) 카를로스 3 세 건강 연구소, 보건의 스페인에서 PI13/01098 부여. DB-G 했다 유럽 연합 일곱 번째 기구 프로그램 (FP7 2007-2013 년) 부여 계약 603049 (TRANSLINK) 아래에 의해 투자 하는 박사 후 연구 위치에서 혜택을. NK, NS, NB의 일 부여 #14-50-00131 러시아 과학 재단에 의해 지원 되었다. DB-G 마르타 Broto, J. 파블로 살바도르와 우수한 기술 지원, 애 나 Sanchis 및 알렉산더 Rakitko 통계 분석에 그의 감사를 표현 하 고 싶어. 지원으로는 “Pla 드 Doctorats 주 드 라 Secretaria d’Universitats 나 Recerca del Departament d’Empresa 나 Coneixement 드 라 Generalitat 드 Catalunya (부여 번호 2018 디 021). 우리는 검색 프로그램 감사 / Generalitat 드 Catalunya 제도적 지원에 대 한.
Materials
| Antibodies | |||
| biotinylated goat anti-human Igs | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Ref. #: 31782 | |
| biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: 31807 | |
| Equipment | |||
| Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5 | Scienion AG, Berlin, Germany | http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/ | |
| Stain Tray (slide incubation chamber) | Simport, Beloeil, QC, Canada | Ref. #: M920-2 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | Ref. #: 5810 R | |
| Pipettes | Gilson, Middleton, WI, USA | http://www.gilson.com/en/Pipette/ | |
| Slide Scanner | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | ScanArray GX Plus | |
| Shaking incubator | Cole-Parmer, Staffordshire, UK | Ref. #: SI50 | |
| Biological samples | |||
| BALB/c mice sera | This paper | N/ A | |
| Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) | Immuno-Gem, Moscow, Russia | http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531 | |
| Chemicals, Reagents and Glycans | |||
| Glycan library | Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia | N/ A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, | Ref. #: A9418 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | Ref. #: 411000 | |
| Tween-20 | Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain | Ref. #: 655204 | |
| Phospahte buffered saline (PBS) | VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain | Ref. #: E404 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Ref. #: S2002 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: S21381 | |
| Streptavidin Cy5 conjugate | GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK | Ref. #: PA45001 | |
| Materials | |||
| N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H | Schott-Nexterion, Jena, Germany | Ref. #: 1070936 | |
| Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | Ref. #: WHA10347509 | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Ref. #: 0030120086 | |
| Software and algorithms | |||
| ScanArray Express Microarray Analysis System | PerkinElmer | http://www.per | |
| kinelmer.com/microarray | |||
| Hierarchical Clustering Explorer application | University of Maryland, MD, USA | http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/ | |
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