Gedruckte Glycan Array: Eine sensible Technik für die Analyse des Repertoires der zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat in Kleintiere
Summary
Diese Arbeit zeigt das Potenzial der gedruckten Glycan Array (PGA) Technologie für die Analyse von zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat bei Kleintieren.
Abstract
Das Repertoire des zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat von einem bestimmten Individuum ist häufig verbunden mit seiner immunologischen Status. Nicht nur die einzelnen immun Zustand entscheidet über den Erfolg bei der Bekämpfung von internen und externen potenzielle Bedrohung Signale, sondern auch die Existenz eines bestimmten Musters der zirkulierenden Anti-Glykan Antikörper (und ihren serologischen Ebene Variation) könnte sein, eine deutliche Markierung von der Entstehung und Progression von bestimmten pathologischen Zuständen. Hier beschreiben wir eine gedruckt Glycan Array PGA-basierte Methode, die bietet die Möglichkeit, Hunderte von Glycan Ziele mit sehr hoher Empfindlichkeit zu messen; mit einer minimalen Menge an Beispiel, das ist eine gemeinsame Beschränkung vorhanden, wenn kleine Tiere (Ratten, Mäuse, Hamster, etc.) dienen als Modelle zur Adresse Aspekte menschlicher Krankheiten. Als ein repräsentatives Beispiel für diesen Ansatz zeigen wir die Ergebnisse aus der Analyse des Repertoires der natürlichen Anti-Glykan Antikörper in Mäusen BALB/c. Wir zeigen, dass jede BALB/c Maus an der Studie, trotz genetisch identisch und gepflegt unter den gleichen Bedingungen ein bestimmtes Muster der natürlichen Anti-Kohlenhydrat-Antikörper entwickelt. Diese Arbeit behauptet, die Verwendung von PGA-Technologie zu untersuchen, Repertoire (Besonderheiten) und das Niveau der zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrate, in Gesundheit und während jeder Krankheitszustand zu erweitern.
Introduction
Antikörper spielen eine zentrale Rolle in unserer Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger durch direkt neutralisieren Viren1,2 und Bakterien2,3, durch die Aktivierung der Ergänzung System4,5 und die Verbesserung der Phagozytose6. Darüber hinaus sind sie wesentliche Elemente in Krebs targeting und Beseitigung von bösartigen Zellen7und Homöostase Wartung8,9.
Autoimmun-und Entzündungserkrankungen10 und Krebs11können Störungen des Immunsystems führen. Diese pathologischen Bedingungen erfordern idealerweise eine schnelle Diagnose für eine effiziente Behandlung. Bei Autoimmunerkrankungen ist die serologische Präsenz der Autoantikörper in den meisten Fällen ein Prädiktor für die Diagnose von Autoimmunität10,12. Diese Antikörper reagieren mit der Zelloberfläche und extrazelluläre Autoantigene, und sie sind oft seit vielen Jahren vor der Präsentation der Autoimmunerkrankung10,12. Immunschwäche und Krebs sind auch Blutuntersuchungen diagnostiziert, dass entweder immun Elemente wie Antikörper oder ihre funktionelle Aktivität11messen.
Die Identifikation des Repertoires der zirkulierenden Antikörper und ihre serologischen Ebenen sind ausschlaggebend für eine Prognose festlegen und das Fortschreiten der aller genannten pathologischen Bedingungen zu bewerten. Wir haben zuvor das Potenzial der PGA-Technik für die Analyse von zirkulierenden Antikörper in verschiedenen Tierarten13–16, bewiesen, Minimierung des Einsatzes großer Mengen von serologische Proben, Vermeidung des Problems Antikörper Kreuzreaktivität17 und ermöglicht Hochdurchsatz-Profilierung der ein umfangreiches Repertoire an Antikörpern15zugeordnet.
Glykan-basierten Immunoassays sind hauptsächlich bedingt unter anderem durch die Herkunft und Herstellung der Kohlenhydrate, die die Affinität und Bindung des Liganden15,18,19,20 zu bestimmen, ,21. Glykan-basierten Immunoassays können in Suspension (Mikrokügelchen)15,21,22 oder in Wohnung-aktivierte Oberflächen15,21,22entwickelt werden, 23,24. Die letzte gehören ELISA (die meisten konventionellen Methoden) und PGA. Es gibt nicht viele Daten vergleicht man diese Methoden in der gleichen experimentellen Einstellung15,25,26,27. Zuvor haben wir die Wirksamkeit und Selektivität dieser Immunoassays zum Profil Anti-Glykan Antikörper in individuellen menschlichem Plasma Proben15verglichen. Für einige Antikörper wie diese gezielt Anti-A/B-Blutgruppe die Immunoassays konnte sie mit statistischer Signifikanz erkennen und sie positiv korreliert mit einander15,18,21. Unterdessen Anti-P1 Antikörper wurden in erster Linie mit der höchsten Trennschärfe von PGA erkannt, und es gab keine Korrelation in den Feststellungen der verschiedenen Glycan-basierten Immunoassays15,18, 21. diese Unterschiede zwischen den Methoden wurden vor allem im Zusammenhang mit der Antikörper/Antigen-Verhältnis und Glycan Orientierung15. ELISA und Federung Arrays sind anfälliger für unspezifische Bindung als PGA, denn es eine Überschreitung des Antigens Antikörper in diesen Methoden15 gibt. Darüber hinaus ist die Ausrichtung von Glykoproteinen in der PGA restriktiver als in ELISA und Aussetzung Arrays15. ELISA ist praktisch, wenn die Studie eine begrenzte Gruppe von Glykane enthält. ELISA bietet neben Aussetzung Arrays größere Flexibilität im Hinblick auf Assay Neukonfiguration. PGA ist besonders praktisch für Entdeckung Ansätze15,18,21,28. Trotz dieser klaren Vorteile und Nachteile könnte der drei genannten Immunoassays verwendet werden, um verschiedene Aspekte der Glycan-Antikörper Interaktionen zu studieren. Das endgültige Ziel der Studie ist, dass einerseits die Auswahl geeigneter Methoden leiten wird.
Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, die Verwendung von PGA-Technologie für die Analyse des Repertoires der zirkulierenden Anti-Glykan Antikörper bei kleinen Tieren zu erweitern. Als ein repräsentatives Ergebnis präsentieren wir Ihnen hier ein detailliertes Protokoll, um das Repertoire der natürlichen Anti-Kohlenhydrat-Antikörper bei Erwachsenen BALB/c Mäusen von PGA zu beurteilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Glycan Microarrays sind unverzichtbare Werkzeuge für die Untersuchung von Protein-Glycan Interaktionen40geworden. Die vorliegende Arbeit beschreibt ein Protokoll basiert auf PGA-Technologie, das Repertoire der zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat in den BALB/c Mäusen zu studieren. Da PGA die Möglichkeit, Bildschirm zahlreicher biologisch unbekannten handelt bietet, ist es eine außergewöhnlich günstige Discovery Tool13,15…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch “Fondo de Investigaciones Sanitarias” (FIS) gewähren PI13/01098 von Carlos III Health Institute, des spanischen Gesundheitsministeriums. DB-G wurde von einer doctoral Research Position gefördert durch die Europäische Union siebten Rahmenprogramm (RP7/2007-2013) unter Grant Agreement 603049 (TRANSLINK) profitiert. NK, NS, und NB wurde von Grant #14-50-00131 der russischen Science Foundation unterstützt. DB-G will seine Dankbarkeit gegenüber Marta Broto, J. Pablo Salvador und Ana Sanchis für hervorragende technische Unterstützung und Alexander Rakitko um Hilfe bei der statistischen Analyse zum Ausdruck bringen. Mit der Unterstützung der “Pla de Doctorats Industrials De La Secretaria d’Universitats ich Recerca del Departament d’Empresa ich Coneixement De La Generalitat de Catalunya (Gewährungsnummer 2018 DI 021). Wir bedanken uns bei CERCA Programm / Generalitat de Catalunya für institutionelle Unterstützung.
Materials
| Antibodies | |||
| biotinylated goat anti-human Igs | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Ref. #: 31782 | |
| biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: 31807 | |
| Equipment | |||
| Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5 | Scienion AG, Berlin, Germany | http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/ | |
| Stain Tray (slide incubation chamber) | Simport, Beloeil, QC, Canada | Ref. #: M920-2 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | Ref. #: 5810 R | |
| Pipettes | Gilson, Middleton, WI, USA | http://www.gilson.com/en/Pipette/ | |
| Slide Scanner | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | ScanArray GX Plus | |
| Shaking incubator | Cole-Parmer, Staffordshire, UK | Ref. #: SI50 | |
| Biological samples | |||
| BALB/c mice sera | This paper | N/ A | |
| Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) | Immuno-Gem, Moscow, Russia | http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531 | |
| Chemicals, Reagents and Glycans | |||
| Glycan library | Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia | N/ A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, | Ref. #: A9418 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | Ref. #: 411000 | |
| Tween-20 | Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain | Ref. #: 655204 | |
| Phospahte buffered saline (PBS) | VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain | Ref. #: E404 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Ref. #: S2002 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: S21381 | |
| Streptavidin Cy5 conjugate | GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK | Ref. #: PA45001 | |
| Materials | |||
| N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H | Schott-Nexterion, Jena, Germany | Ref. #: 1070936 | |
| Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | Ref. #: WHA10347509 | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Ref. #: 0030120086 | |
| Software and algorithms | |||
| ScanArray Express Microarray Analysis System | PerkinElmer | http://www.per | |
| kinelmer.com/microarray | |||
| Hierarchical Clustering Explorer application | University of Maryland, MD, USA | http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/ | |
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