JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Immunologie et infection

Trykte Glycan matrix: En følsom teknik til analyse af Repertoire af cirkulerende anti-kulhydrat antistoffer i små dyr

Published: February 14, 2019
doi:
10.3791/57662
, , , , , , , , , ,
1Infectious Pathology and Transplantation Division,Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh),Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department,Bellvitge University Hospital

Summary

Dette arbejde viser potentiale af trykte glycan array (PGA) teknologi til analyse af cirkulerende anti-kulhydrat antistoffer i små dyr.

Abstract

Repertoire af cirkulerende anti-kulhydrat antistoffer af en given person er ofte forbundet med immunologiske status. Ikke kun den enkelte immun tilstand bestemmer succes i bekæmpelsen af interne og eksterne potentielle trussel signaler, men også eksistensen af et bestemt mønster af cirkulerende anti-glycan antistoffer (og deres serologisk niveau variation) kunne være en væsentlig markør for debut og progression af visse patologiske tilstande. Her beskriver vi trykt Glycan Array PGA-baserede metoder, som giver mulighed for at måle hundredvis af glycan mål med meget høj følsomhed; ved hjælp af en minimal mængde af prøven, som er en fælles begrænsning når små dyr (rotter, mus, hamster, osv.) anvendes som modeller til adresse aspekter af sygdomme hos mennesker. Som et repræsentativt eksempel på denne tilgang viser vi resultaterne fra analysen af repertoire af naturlige anti-glycan antistoffer i BALB/c mus. Vi viser, at hver BALB/c mus involveret i undersøgelsen, på trods af at være genetisk identiske og vedligeholdes på samme betingelser, udvikler et bestemt mønster af naturlige anti-kulhydrat antistoffer. Dette arbejde hævder at udvide brugen af PGA teknologi at undersøge repertoire (særlige) og niveauer af cirkulerende anti-kulhydrater antistoffer, både i sundhed og under en patologisk tilstand.

Introduction

Antistoffer spiller en central rolle i vores forsvar mod invaderende patogener af direkte neutralisere virus1,2 og bakterier2,3, ved at aktivere komplement systemet4,5 og styrkelse af fagocytose6. Derudover er de væsentlige elementer i kræft målretning og afskaffelse af maligne celler7og homøostase vedligeholdelse8,9.

Sygdomme i immunsystemet kan resultere i autoimmune og inflammatoriske sygdomme10 og kræft11. Alle disse patologiske tilstande ideelt set kræver en hurtig diagnose for en effektiv behandling. I forbindelse med autoimmune sygdomme er serologisk tilstedeværelsen af autoantistoffer i de fleste tilfælde en prædiktor for diagnosticering af autoimmunitet10,12. Disse antistoffer reagere med celleoverfladen og ekstracellulære autoantigens, og de er ofte til stede i mange år før præsentationen af autoimmun sygdom10,12. Immun mangler og kræft er også diagnosticeret med blodprøver at enten måle niveauet af immun elementer såsom antistoffer, eller deres funktionelle aktivitet11.

Identifikation af repertoire af cirkulerende antistoffer og deres serologisk niveauer er afgørende at sætte en prognose og evaluere progression af alle de nævnte patologiske betingelser. Vi har tidligere vist potentiale af PGA teknik til analyse af cirkulerende antistoffer i forskellige dyrearter13–16, minimere brugen af store mængder af serologiske prøver, undgå problemet forbundet med antistoffer krydsreaktivitet17 og giver høj overførselshastighed profilering af en omfattende repertoire af antistoffer15.

Glycan-baserede immunassays er hovedsageligt betinget, blandt andre faktorer af oprindelse og produktion af kulhydrater, som bestemmer affinitet og binding af ligander15,18,19,20 ,21. Glycan-baserede immunassays kan udvikles i suspension (mikrokugler)15,21,22 eller i flade-aktiveret overflader15,21,22,, 23,24. Sidst omfatter ELISA (den mest almindelige af disse metoder) og PGA. Der er ikke mange data sammenligner disse metoder i den samme eksperimentelle indstilling15,25,26,27. Vi har tidligere sammenlignede effekten og selektivitet af disse immunassays til profil anti-glycan antistoffer i individuelle humant plasma prøver15. For nogle antistoffer som disse målretning anti-A/B-blodtype, alle immunassays kunne detektere dem med Statistisk signifikans og de korreleret positivt med hinanden15,18,21. I mellemtiden, anti-P1 antistoffer blev primært registreret ved PGA med den højeste diskriminerende magt, og der var ingen korrelation i afgoerelserne af forskellige glycan-baserede immunassays15,18, 21. disse forskelle mellem metoder var primært relateret til antistof/antigen-forholdet og glycan orientering-15. ELISA og suspension arrays er mere modtagelige for uspecifik bindende end PGA, fordi der er en overskridelse af antigen antistoffer i disse metoder15. Derudover er orienteringen af glycans i PGA mere begrænset end i ELISA og suspension arrays15. ELISA er praktisk, når undersøgelsen omfatter en begrænset panel af glycans. Sammen med suspension arrays tilbyder ELISA større fleksibilitet med hensyn til analysen omkonfiguration. PGA er yderst bekvemt for discovery tilgange15,18,21,28. Trods disse klare fordele og ulemper, kunne de tre nævnte immunassays bruges til at studere forskellige aspekter af glycan-antistof interaktioner. Det endelige mål for undersøgelsen er den, der vil guide udvælgelse af den mere egnet metodologi.

Nuværende arbejde har til formål at udvide anvendelsen af PGA teknologi til analyse af repertoire af cirkulerende anti-glycan antistoffer i små dyr. Som en repræsentant resultat præsenterer vi her en detaljeret protokol for at vurdere repertoire af naturlige anti-kulhydrat antistoffer hos voksne BALB/c mus af PGA.

Protocol

1. Glycochips produktion Microarray forberedelse Udskrive glycans (50 mM) og polysakkarider (10 µg/mL) i 300 mM phosphat bufferet saltvand (PBS, pH 8,5) på 6 replikater på N-hydroxysuccinimide-derivatized glas dias, ved hjælp af ikke-kontakt robot arrayer (drop volumen ~ 900 pL). Hvert dias indeholder 4 forskellige blokke af sub arrays (figur 1A, i farver) gentaget 6 gange. Hver enkelt sub array er dannet af 112 forskellige glycan steder, herunder ko…

Representative Results

Her præsenterer vi en oversigt over repræsentative resultater af kvantificeringen af repertoire af naturlige anti-glycan antistoffer i en befolkning på 20 BALB/c mus. Glycochips anvendes i denne undersøgelse indeholdt 419 forskellige glycan strukturer. De fleste glycans blev syntetiseret som -CH2CH2CH2NH2 spacer-bevæbnet O-glycosider, i flere tilfælde som -CH2CH2NH2 eller -NHCOCH2NH…

Discussion

Glycan microarrays er blevet uundværlige værktøjer til at undersøge protein-glycan interaktioner40. Den nuværende arbejde beskriver en protokol baseret på PGA teknologi at studere repertoire af cirkulerende af anti-kulhydrat antistoffer i BALB/c mus. Da PGA giver mulighed for at skærmen stort antal biologisk ukendt glycans, er det en usædvanlig praktisk opdagelse værktøj13,15,28. Den foreslåede…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af “Fondo de Investigaciones Sanitarias” (FIS) give PI13/01098 fra Carlos III Health Institute, spanske sundhedsministerium. DB-G blev nydt en Postdoktoral forskning holdning finansieret af EU ‘s syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under Grant aftale 603049 (TRANSLINK). Arbejde af NK, NS, og NB blev støttet af tilskud #14-50-00131 af russisk Science Foundation. DB-G ønsker at udtrykke sin tak til Marta Broto, J. Pablo Salvador og Ana Sanchis for fremragende teknisk bistand og Alexander Rakitko for assistance i statistisk analyse. Med støtte fra den “Pla de Doctorats Industrials de la Secretaria d’Universitats jeg Recerca del Departament d’Empresa jeg Coneixement de la Generalitat de Catalunya (giver 2018 DI 021). Vi takker CERCA program / Generalitat de Catalunya til institutionel støtte.

Materials

Antibodies
biotinylated goat anti-human Igs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Ref. #: 31782
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG Thermo Fisher Scientific Ref. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5  Scienion AG, Berlin, Germany http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber) Simport, Beloeil, QC, Canada Ref. #: M920-2
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany  Ref. #: 5810 R
Pipettes Gilson, Middleton, WI, USA http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slide Scanner  PerkinElmer, Waltham, MA, USA ScanArray GX Plus 
Shaking incubator Cole-Parmer, Staffordshire, UK Ref. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice sera This paper N/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) Immuno-Gem, Moscow, Russia http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemicals, Reagents and Glycans 
Glycan library Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia N/ A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,  Ref. #: A9418
Ethanolamine Sigma-Aldrich Ref. #: 411000
Tween-20 Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain Ref. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS) VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain Ref. #: E404
Sodium azide Sigma-Aldrich Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate  Thermo Fisher Scientific Ref. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugate GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK Ref. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H  Schott-Nexterion, Jena, Germany Ref. #: 1070936
Whatman filter paper  Sigma-Aldrich Ref. #: WHA10347509
1.5 mL tubes Eppendorf  Ref. #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis System PerkinElmer http://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer application University of Maryland, MD, USA http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karlsson, G. B., Fouchier, R. A., Phogat, S., Burton, D. R., Sodroski, J., Wyatt, R. T. The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus. Nat Rev Microbiol. 6 (2), 143-155 (2008).
  2. Lu, L. L., Suscovich, T. J., Fortune, S. M., Alter, G. Beyond binding: antibody effector functions in infectious diseases. Nat Rev Immunol. 18 (1), 46-61 (2017).
  3. Bebbington, C., Yarranton, G. Antibodies for the treatment of bacterial infections: current experience and future prospects. Curr Opin Biotech. 19 (6), 613-619 (2008).
  4. Murphy, K., Travers, P., Walport, M. The complement system and innate immunity. Janeway’s Immunobiology. , 61-80 (2008).
  5. Botto, M., Kirschfink, M., Macor, P., Pickering, M. C., Wurzner, R., Tedesco, F. Complement in human diseases: lessons from complement deficiencies. Mol Immunol. 46 (14), 2774-2783 (2009).
  6. Borrok, M. J., et al. Enhancement of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by endowing IgG with FcαRI (CD89) binding. MAbs. 7 (4), 743-751 (2015).
  7. Weiner, L. M., Murray, J. C., Shuptrine, C. W. Antibody-based immunotherapy of cancer. Cell. 148 (6), 1081-1084 (2012).
  8. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nat Immunol. 11 (9), 785-797 (2010).
  9. Prechl, J. A generalized quantitative antibody homeostasis model: antigen saturation, natural antibodies and a quantitative antibody network. Clin Transl Immunology. 6 (2), e131 (2017).
  10. Vojdani, A. Antibodies as predictors of complex autoimmune diseases. Int J Immunopath Ph. 21 (2), 267-278 (2008).
  11. Liu, W., Peng, B., Lu, Y., Xu, W., Qian, W., Zhang, J. Y. Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis. Autoimmun Rev. 10 (6), 331-335 (2011).
  12. Suurmond, J., Diamond, B. Autoantibodies in systemic autoimmune diseases: specificity and pathogenicity. J Clin Invest. 125 (6), 2194-2202 (2015).
  13. Bovin, N., et al. Repertoire of human natural anti-glycan immunoglobulins. Do we have auto-antibodies?. Biochim Biophys Acta. 1820 (9), 1373-1382 (2012).
  14. de los Rios, M., Criscitiello, M. F., Smider, V. V. Structural and genetic diversity in antibody repertoires from diverse species. Curr Opin Struc Biol. 33, 27-41 (2015).
  15. Pochechueva, T., et al. Comparison of printed glycan array, suspension array and ELISA in the detection of human anti-glycan antibodies. Glycoconjugate J. 28 (8-9), 507-517 (2011).
  16. Shilova, N., Navakouski, M., Khasbiullina, N., Blixt, O., Bovin, N. Printed glycan array: antibodies as probed in undiluted serum and effects of dilution. Glycoconjugate J. 29 (2-3), 87-91 (2012).
  17. Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17C-23C (2007).
  18. Jacob, F., et al. Serum anti-glycan antibody detection of non-mucinous ovarian cancers by using a printed glycan array. Int. J. Cancer. 130 (1), 138-146 (2012).
  19. Lewallen, D. M., Siler, D., Iyer, S. S. Factors affecting protein-glycan specificity: effect of spacers and incubation time. ChemBioChem. 10 (9), 1486-1489 (2009).
  20. Oyelaran, O., Li, Q., Farnsworth, D., Gildersleeve, J. C. Microarrays with varying carbohydrate density reveal distinct subpopulations of serum antibodies. J. Proteome Res. 8 (7), 3529-3538 (2009).
  21. Pochechueva, T. Multiplex suspension array for human anti-carbohydrate antibody profiling. Analyst. 136 (3), 560-569 (2011).
  22. Chinarev, A. A., Galanina, O. E., Bovin, N. V. Biotinylated multivalent glycoconjugates for surface coating. Methods Mol Biol. 600, 67-78 (2010).
  23. Huflejt, M. E. Anti-carbohydrate antibodies of normal sera: findings, surprises and challenges. Mol Immunol. 46 (15), 3037-3049 (2009).
  24. Buchs, J. P., Nydegger, U. E. Development of an ABO-ELISA for the quantitation of human blood group anti-A and anti-B IgM and IgG antibodies. J Immunol Methods. 118 (1), 37-46 (1989).
  25. de Jager, W., Rijkers, G. T. Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: a comparison. Methods. 38 (4), 294-303 (2006).
  26. Galanina, O. E., Mecklenburg, M., Nifantiev, N. E., Pazynina, G. V., Bovin, N. V. GlycoChip: multiarray for the study of carbohydrate binding proteins. Lab Chip. 3 (4), 260-265 (2003).
  27. Willats, W. G., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: a novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
  28. Bello-Gil, D., Khasbiullina, N., Shilova, N., Bovin, N., Mañez, R. Repertoire of BALB/c mice natural anti-Carbohydrate antibodies: mice vs. humans difference, and otherness of individual animals. Front Immunol. 8, 1449 (2017).
  29. Pazynina, G., et al. Synthetic glyco-O-sulfatome for profiling of human natural antibodies. Carbohydr Res. 445, 23-31 (2017).
  30. Ryzhov, I. M., Korchagina, E. Y., Popova, I. S., Tyrtysh, T. V., Paramonov, A. S., Bovin, N. V. Block synthesis of A (type 2) and B (type 2) tetrasaccharides related to the human ABO blood group system. Carbohydr Res. 430, 59-71 (2016).
  31. Ryzhov, I. M., et al. Function-spacer-lipid constructs of Lewis and chimeric Lewis/ABH glycans. Synthesis and use in serological studies. Carbohyd Res. 435, 83-96 (2016).
  32. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Tuzikov, A. B., Bovin, N. V. Stereo- and regio-selective synthesis of spacer armed α2-6 sialooligosaccharides. Mendeleev Commun. 26 (5), 380-382 (2016).
  33. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Formanovsky, A. A., Bovin, N. V. Synthesis of blood group pentasaccharides ALey, BLey and related tri- and tetrasaccharides. Mendeleev Commun. 26 (2), 103-105 (2016).
  34. Severov, V. V., Pazynina, G. V., Ovchinnikova, T. V., Bovin, N. V. The synthesis of oligosaccharides containing internal and terminal Galβ1-3GlcNAcβ fragments. Russian J. Bioorgan. Chem. 41 (2), 147-160 (2015).
  35. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Bovin, N. V. Synthesis of glycoprotein N-chain core fragment GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc. Mendeleev Commun. 25 (4), 250-251 (2015).
  36. Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
  37. Pazynina, G. V., et al. Divergent strategy for the synthesis of α2-3-Linked sialo-oligosaccharide libraries using a Neu5TFA-(α2-3)-Gal building block. Synlett. 24 (02), 226-230 (2013).
  38. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. P Natl Acad Sci USA. 101 (49), 17033-17038 (2004).
  39. Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. 27 (4), 280-284 (2017).
  40. Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Cummings, R. D., Smith, D. F. Chemistry of natural glycan microarrays. Curr Opin Chem Biol. 18, 70-77 (2014).
  41. Hoy, Y. E., et al. Variation in taxonomic composition of the fecal microbiota in an inbred mouse strain across individuals and time. PLoS One. 10 (11), e0142825 (2015).
  42. D’Argenio, V., Salvatore, F. The role of the gut microbiome in the healthy adult status. Clin Chim Acta. 451 (Pt A), 97-102 (2015).
  43. Khasbiullina, N. R., Bovin, N. V. Hypotheses of the origin of natural antibodies: a glycobiologist’s opinion. Biochemistry (Mosc). 80 (7), 820-835 (2015).
  44. Butler, J. E., Sun, J., Weber, P., Navarro, P., Francis, D. Antibody repertoire development in fetal and newborn piglets, III. Colonization of the gastrointestinal tract selectively diversifies the preimmune repertoire in mucosal lymphoid tissues. Immunology. 100 (1), 119-130 (2000).
  45. Bos, N. A., et al. Serum immunoglobulin levels and naturally occurring antibodies against carbohydrate antigens in germ-free BALB/c mice fed chemically defined ultrafiltered diet. Eur J Immunol. 19 (12), 2335-2339 (1980).
  46. van der Heijden, P. J., Bianchi, A. T., Heidt, P. J., Stok, W., Bokhout, B. A. Background (spontaneous) immunoglobulin production in the murine small intestine before and after weaning. J Reprod Immunol. 15 (3), 217-227 (1989).
  47. Krasnova, L., Wong, C. H. Understanding the chemistry and biology of glycosylation with glycan synthesis. Annu Rev Biochem. 85, 599-630 (2016).
  48. Overkleeft, H. S., Seeberger, P. H., Varki, A. Chemoenzymatic synthesis of glycans and glycoconjugates. Essentials of Glycobiology [Internet]. , 2015-2017 (2017).

Tags

Glycan ArrayAnti-carbohydrate AntibodiesSmall AnimalsSerumPrinted Glycan ArrayGlycan TargetsPolysaccharidesPBSN-hydroxy 6 Cinnamic Derivatized Glass SlidesBlocking BufferBufferMice SerumImmunoglobulin AggregationCentrifugationIncubation Chamber
check_url/fr/57662?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., Nokel, A., Formanovsky, A., Popova, I., Tyrtysh, T., Kunetskiy, R., Shilova, N., Bovin, N., Bello-Gil, D., Mañez, R. Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals. J. Vis. Exp. (144), e57662, doi:10.3791/57662 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image