Идентификация Циклин зависимая киназа 1 сайты конкретных фосфорилирование киназы в Vitro пробирного
Summary
Циклин зависимая киназа 1 (Cdk1) активируется в G2 фазе клеточного цикла и регулирует многие сотовых пути. Здесь мы представляем протокол assay киназы в пробирке с Cdk1, который позволяет идентифицировать Cdk1-конкретных фосфорилирование сайтов для создания клеточных мишеней этой важной киназы.
Abstract
Циклин зависимая киназа 1 (Cdk1) представляет собой главный контроллер для клеточного цикла в всех эукариот и фосфорилирует оценкам 8-13% протеома; Однако количество выявленных целей для Cdk1, особенно в клетках человека по-прежнему низка. Определение участков фосфорилирование Cdk1-конкретных важно, как они обеспечивают механистический понимание как Cdk1 управляет клеточного цикла. Регуляции клеточного цикла имеет решающее значение для верующих хромосома сегрегации, и дефекты в этот сложный процесс приведет к хромосомных аберраций и рака.
Здесь мы описываем в vitro киназы assay который используется для идентификации конкретных Cdk1 фосфорилирования сайтов. В этот assay, очищенный белок является фосфорилированных в пробирке , коммерчески доступных человека Cdk1/циклин B. успешный фосфорилирование подтверждается SDS-PAGE, и впоследствии фосфорилирование сайты идентифицируются по масс-спектрометрии. Мы также описывают протоколы очищения, которые дают очень чистые и однородные белковых препаратов для assay киназы и пробирного привязки для функциональной проверки выявленных фосфорилирования сайтов, которые исследует взаимодействие между Классическая ядерной локализации сигнал (cNLS) и его перевозки ядерных рецепторов karyopherin α. Для помощи с экспериментального дизайна, мы рассматриваем подходы для прогнозирования фосфорилирование Cdk1-конкретных сайтов от белковых последовательностей. Вместе эти протоколы представляют очень мощный подход, который дает фосфорилирование Cdk1-конкретных сайтов и позволяет механистический исследования в как Cdk1 управляет клеточного цикла. Поскольку этот метод опирается на очищенные белки, может применяться к любой модели организма и дает надежные результаты, особенно в сочетании с функциональных исследований клеток.
Introduction
Киназы являются ферменты, которые регулируют многие клеточные процессы и передачи фосфатные группы от АТФ на субстраты. Этот фосфорилирование является обратимым, быстро, добавляет два отрицательными зарядами и хранит свободной энергии и является одним из наиболее распространенных Посттрансляционная изменений используется клетками. Cdk1, который также известен как гомолога белка 2 цикла деления клеток (cdc2) — это главный контроллер для клеточного цикла в всех эукариот1,2,3,4,5и фосфорилирует оценкам, 8-13% протеома6,7.
Хотя последние протеомических исследований выявили многие сайты фосфорилирование белков, в большинстве случаев, ответственных за эти изменения киназы неизвестна. Количество известных Cdk1 целевые показатели, особенно в клетках человека является низкий7. Определение участков фосфорилирование Cdk1-конкретных имеет важное значение, как он позволяет механистический исследования, которые устанавливают, как Cdk1 управляет клеточного цикла. Регуляции клеточного цикла важно для верных хромосома сегрегации и деление клеток, и множество клеточных процессов должны произойти для поддержки этой важной физиологические функции. Это включает в себя прекращение транскрипции и трансляции до начала митоза, а также драматические реорганизации в клеточной структуры и организации, например разборка ядерная оболочка, конденсация хромосом и митотического шпинделя собраний. Ошибки в этих процессах и дерегулирование вызывают рак, врожденные дефекты или митотическая клеточной смерти. Специфичные ингибиторы Cdk1 как RO-3306 были развитыми8, которые обеспечивают мощные инструменты для функциональных исследований, и некоторые из этих ингибиторов в настоящее время в клинических испытаниях для лечения рака (см.9 для обзора).
Здесь мы описываем в vitro киназы assay который позволяет идентифицировать фосфорилирование Cdk1-конкретных сайтов. В этот assay коммерчески доступных человека Cdk1/циклин B используется для фосфорилировать очищенный целевого белка в пробирке. Фосфорилирование субстрата увеличивает его массы и добавляет два негативных обвинения; Таким образом успешные фосфорилирование подтверждается сдвигу вверх группы гель белка на SDS-PAGE. Впоследствии фосфорилирование Cdk1-конкретные сайты идентифицируются по масс-спектрометрии анализа белка в vitro фосфорилированных. Для помощи с экспериментального дизайна, мы также обзор вычислительных средств и ссылки для прогнозирования фосфорилирование Cdk1-конкретных сайтов из последовательности белка. Кроме того мы также описывают протоколы очищения, которые дают очень чистые и однородные белковых препаратов подходит для assay киназы. Наконец выявленных фосфорилирование сайты должны быть проверены на функциональные исследования, и простой привязки пробирного описан здесь для этой цели. Комбинированные, это очень мощный подход, который дает фосфорилирование Cdk1-конкретных сайтов и позволяет механистический исследования в как Cdk1 управляет клеточного цикла7,10,11. Поскольку этот метод опирается на очищенных белков, он может применяться к любой модели организма и дает надежные результаты. Однако, рекомендуется функциональной верификации полученных фосфорилирование сайтов в пробирке , поскольку клетки имеют дополнительные механизмы регулирования в месте, например Посттрансляционная модификаций, взаимодействия партнеров или клеточной локализации, может сделать фосфорилирование сайты доступными или недоступными для признания Cdk1.
Cdk1 признает консенсус фосфорилирование сайт, который состоит из (Ser/Чет-Pro-X-Lys/Arg), где X — это остатки и серина или треонин сайт фосфорилирования. Особенно важное значение для признания является наличие пролина в положении + 1. Кроме того, основные остатков предпочтительны в позиции + 2 и + 3, большинство сайтов фосфорилирование Cdk1-конкретным, содержащий Lys или Arg на + 3 позиция6,12.
Активация Cdk1 жестко регулируется и приводит к возникновению митоз1,2,3,4,5. Деятельность циклин зависимых киназ в целом зависит от их ассоциации с собственный циклинов (циклин A, B, C, D и E в организме человека), которые выражаются в колебательных уровнях на протяжении клеточного цикла13. Выражение Cdk1 является постоянным по всей клеточного цикла и регулирование своей деятельности опирается на его связь с нормативной субблоков циклин A и циклин B5,13,14,15, как Ну как столб-поступательные изменения. Формирование комплекса Cdk1/циклин B требуется для киназы активации5,14,,1516,17,18. В G2 фазе циклин B переведен в цитозоле и импортированы в ядре, где он привязывается к Cdk15,14,,1516,17,18; Однако Cdk1/циклин B проводится инактивированных фосфорилирования в остатки Thr14 и Tyr15 на человека Cdk1-тормозящий киназы Myt1 (связанный мембранами перст-тирозин треонин конкретных и cdc2-тормозящий киназы) и Wee1, соответственно19, 20,21. В конце фазы G2 дефосфорилирование Thr14 и Tyr15 путем деления клеток цикла 25 фосфатазы (cdc25) активизирует деятельность киназы Cdk1/циклин B комплекса и инициирует начало митоз12,14, 18 , 20 , 22 , 23. фосфорилирование Thr161 также необходим для активации Cdk1/циклин B и опосредовано Cdk7, Cdk активации киназы (ЦАК)18. Деградации циклин b в анафазе инактивирует Cdk1, позволяя выход из митоз24,25. Активация Cdk1/циклин B поэтому является сложным процессом. Протокола, представленные здесь выполняется с коммерчески доступных Cdk1/циклин б. В ходе рекомбинантных выражение этого комплекса в клетках насекомых это активированные в vivo эндогенного киназы14,20 и остается активным в состоянии очищенных. Итоговый активная, рекомбинантного человеческого Cdk1/циклин B подходит для в vitro киназы анализов.
Здесь мы описываем протокол для идентификации конкретных Cdk1 фосфорилирования сайтов в человека центромер протеина F (CENP-F)10. CENP-F это Кинетохор белок, который проживает в ядре в течение большей части межфазовые изолирующие (G1 и S-фазы) и экспортируется в цитозоль в G2 фазе26,27,28 Cdk1-зависимых образом10, 11. ядерной локализации присуждается двудольных жизнь26. cNLSs распознаются α karyopherin фактор ядерного транспорта, который облегчает, вместе с karyopherin β и RanGDP, импорт жизнь грузов в ядро29. Ядерного экспорта в G2 фазе обеспечивается через путь неизвестным экспорта10. После того, как CENP-F находится в цитозоле, он нанят для того, чтобы ядерная оболочка и в свою очередь набирает30,комплекс Динеин двигательные белки31. Этот путь имеет важное значение для позиции соответствующих Центросома ядро на начальных стадиях митотического шпинделя Ассамблеи образом Динеин зависимых, который имеет важное значение для правильного времени митотическая входа и основных процессов в мозге развития30,,3132. Начиная с этапа G2, CENP-F является также смонтирован в Кинетохор где он имеет важную роль для верных хромосома сегрегации27,28,33,34,35 . Ключевым шагом регулирования этих путей является ядерным экспортом CENP-F в G2 фазе, которая зависит от Cdk110,11. Мы здесь описать протокол для идентификации Cdk1-конкретных сайтов фосфорилирования в жизнь CENP-F. Phosphomimetic перегласовок этих сайтов замедлить ядерного импорта CENP-f, предполагая, что Cdk1/циклин B непосредственно регулирует клеточной локализации CENP-F, фосфорилирование его жизнь10.
В целом этот assay в vitro киназы позволяет выявлять конкретные субстраты для киназы Cdk1. очищенные целевых белков, фосфорилированных в vitro коммерчески доступных Cdk1/циклин B комплекс и фосфорилирование сайты Впоследствии идентифицируются по масс-спектрометрии. Определение участков фосфорилирование Cdk1-конкретных поддерживает механистический исследования, которые показывают, как Cdk1 управляет клеточного цикла.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наши в vitro киназы пробирного является очень мощный метод идентификации молекулярных целей для киназы Cdk1, который представляет собой главный контроллер клеточного цикла и регулирует многие важные клеточные процессы. Этот метод определяет, если очищенный белок является субстратом…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Дэвид Кинг, Говард Хьюз медицинский институт, Университет Калифорнии в Беркли для анализа масс-спектрометрии и полезные замечания. Мы благодарим д-р Ксуилиан Чжу, Шанхай, институты для биологических наук, Китайской академии наук, Шанхай, Китай для предоставления конструкцию полнометражные CENP-F. Наконец мы благодарим д-р Сьюзен Отрава, Брайан Калахен и д-р Кристоф Grewer в университете Бингемтон для доступа к оборудованию. Это исследование финансировалось Фондом исследований государственного университета Нью-Йорка и Кафедра химии университета в Нью-Йорк в Бингамтоне.
Materials
| 2800 ml baffled Fernbach flask | Corning | 44232XL | |
| ampicillin | Gold Biotechnology | A-301-25 | |
| ATP | Fisher Scientfiic | BP413-25 | |
| benzamidine hydrochloride | Millipore Sigma | B6506-25 | |
| bottletop filter | Corning | 431161 | |
| Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL | New England Biolabs | P6020 | |
| Cdk1/cyclin B (alternate source) | EMD Millipore | 14-450 | |
| Cdk1/cyclin B (alternate source) | Invitrogen | PV3292 | |
| Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer | New England Biolabs | P6020 | |
| CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid | Available upon request. | ||
| centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor | Thermo Scientific | 10033-778 | |
| centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes | EMD Millipore | UFC900324 | |
| chlorampenicol | Gold Biotechnology | C-105-100 | |
| D/L methionine | Agros Organics / Fisher | 125650010 | |
| desalting pipet tips: Zip tips | Millipore Sigma | ZTC18S008 | |
| disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm | Biorad | 7321010 | |
| dithiothreitol | Gold Biotechnology | DTT50 | |
| E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain | EMD Millipore | 71403 | |
| electrospray ionization Fourier transform ion | Bruker Amazon | Apex III | |
| cyclotron resonance mass spectrometer | |||
| electrospray ionization ion trap mass spectrometer | Bruker Amazon | custom | |
| fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy | Thermo Scientific | 97040-276 | |
| FPLC system: Äkta Pure FPLC | GE Healthcare | 29032697 | |
| Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| glutathione agarose | Pierce | 16101 | |
| glutathione, reduced | Millipore Sigma | G4251-50g | |
| incubation shaker: multitron shaker | Infors | I10102 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
| kanamycin | Gold Biotechnology | K-120-25 | |
| karyopherin α pet-28a pres plasmid | Available upon request. | ||
| Luria Bertani medium | Fisher Scientfiic | BP1426-2 | |
| microcentrifuge 5418R, refrigerated | Eppendorf | 5401000013 | |
| microtubes (0.5 ml) | Eppendorf | 30121023 | |
| microtubes (1.5 ml) | Eppendorf | 30120086 | |
| Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel | Millipore Sigma | P6611-100ml | |
| pGEX-6P-1 plasmid | Millipore Sigma | GE28-9546-48 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Gold Biotechnology | P470-10 | |
| PS protease: PreScission protease | GE Healthcare | 27084301 | |
| Phos-tag acrylamide | Wako Pure Chem. Ind. | 304-93521 | |
| reduced gluthathione | Millipore Sigma | G4251-50g | |
| roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes) | Fisher Scientfiic | 055291D | |
| site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning | Agilent | 210518 | |
| Site-Directed Mutagenesis Kit | |||
| sonifier: Branson S-250D sonifier | Branson | 15 338 125 | |
| Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff) | Spectrum Labs | 08 670B | |
| swing out rotor TX-1000 | Thermo Scientific | 10033-778 |
References
- Nurse, P. Cyclin dependent kinases and cell cycle control (Nobel Lecture). ChemBioChem. 3 (7), 596-603 (2002).
- Lee, M. G., Nurse, P. Complementation used to clone a human homologue of the fission yeast cell cycle control gene cdc2. Nature. 327, 31 (1987).
- Lohka, M. J., Hayes, M. K., Maller, J. L. Purification of maturation-promoting factor, an intracellular regulator of early mitotic events. Proc Natl Acad of Sci U S A. 85 (9), 3009-3013 (1988).
- Gautier, J., Norbury, C., Lohka, M., Nurse, P., Maller, J. Purified maturation-promoting factor contains the product of a Xenopus homolog of the fission yeast cell cycle control gene. Cell. 54 (3), 433-439 (1988).
- Gautier, J., Minshull, J., Lohka, M., Glotzer, M., Hunt, T., Maller, J. L. Cyclin is a component of maturation-promoting factor from Xenopus. Cell. 60 (3), 487-494 (1990).
- Ubersax, J. A., Woodbury, E. L., Quang, P. N., Paraz, M., Blethrow, J. D., Shah, K., Shokat, K. M., Morgan, D. O. Targets of the cyclin-dependent kinase Cdk1. Nature. 425 (6960), 859-864 (2003).
- Petrone, A., Adamo, M. E., Cheng, C., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2448-2461 (2016).
- Vassilev, L. T., Tovar, C., Chen, S., Knezevic, D., Zhao, X., Sun, H., Heimbrook, D. C., Chen, L. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
- Balakrishnan, A., Vyas, A., Deshpande, K., Vyas, D. Pharmacological cyclin dependent kinase inhibitors: Implications for colorectal cancer. World J Gastroenterol. 22 (7), 2159-2164 (2016).
- Loftus, K. M., Coutavas, E., Cui, H., King, D., Ceravolo, A., Pereiras, D., Solmaz, S. Mechanism for G2 phase-specific nuclear export of the kinetochore protein CENP-F. Cell Cycle. 16 (15), 1414-1429 (2017).
- Baffet, A. D., Hu, D. J., Vallee, R. B. Cdk1 activates pre-mitotic nuclear envelope dynein recruitment and apical nuclear migration in neural stem cells. Dev Cell. 33 (6), 703-716 (2015).
- Songyang, Z., Blechner, S., Hoagland, N., Hoekstra, M. F., Piwnica-Worms, H., Cantley, L. C. Use of an oriented peptide library to determine the optimal substrates of protein kinases. Curr Biol. 4 (11), 973-982 (1994).
- Malumbres, M. Cyclin-dependent kinases. Genome Biol. 15 (6), 122 (2014).
- Peeper, D. S., Parker, L. L., Ewen, M. E., Toebes, M., Hall, F. L., Xu, M., Zantema, A., van der Eb, A. J., Piwnica-Worms, H. A- and B-type cyclins differentially modulate substrate specificity of cyclin-cdk complexes. EMBO J. 12 (5), 1947-1954 (1993).
- Trembley, J., Ebbert, J., Kren, B., Steer, C. Differential regulation of cyclin B1 RNA and protein expression during hepatocyte growth in vivo. Cell Growth Differ. 7 (7), 903-916 (1996).
- Pines, J., Hunter, T. The differential localization of human cyclins A and B is due to a cytoplasmic retention signal in cyclin B. EMBO J. 13 (16), 3772-3781 (1994).
- Morgan, D. O. Principles of CDK regulation. Nature. 374, 131 (1995).
- Larochelle, S., Merrick, K. A., Terret, M. -. E., Wohlbold, L., Barboza, N. M., Zhang, C., Shokat, K. M., Jallepalli, P. V., Fisher, R. P. Requirements for Cdk7 in the assembly of Cdk1/cyclin B and activation of Cdk2 revealed by chemical genetics in human cells. Mol cell. 25 (6), 839-850 (2007).
- Parker, L. L., Sylvestre, P. J., Byrnes, M. J., Liu, F., Piwnica-Worms, H. Identification of a 95-kDa WEE1-like tyrosine kinase in HeLa cells. Proc Natl Acad of Sci U S A. 92 (21), 9638-9642 (1995).
- Atherton-Fessler, S., Parker, L. L., Geahlen, R. L., Piwnica-Worms, H. Mechanisms of p34cdc2 regulation. Mol Cell Biol. 13 (3), 1675-1685 (1993).
- Liu, F., Stanton, J. J., Wu, Z., Piwnica-Worms, H. The human Myt1 kinase preferentially phosphorylates Cdc2 on threonine 14 and localizes to the endoplasmic reticulum and Golgi complex. Mol Cell Biol. 17 (2), 571-583 (1997).
- McGowan, C. H., Russell, P. Human Wee1 kinase inhibits cell division by phosphorylating p34cdc2 exclusively on Tyr15. EMBO J. 12 (1), 75-85 (1993).
- Strausfeld, U., Labbé, J. C., Fesquet, D., Cavadore, J. C., Picard, A., Sadhu, K., Russell, P., Dorée, M. Dephosphorylation and activation of a p34cdc2/cyclin B complex in vitro by human CDC25 protein. Nature. 351, 242 (1991).
- Leuken, R., Clijsters, L., Wolthuis, R. To cell cycle, swing the APC/C. Biochim Biophys Acta. 1786 (1), 49-59 (2008).
- Acquaviva, C., Pines, J. The anaphase-promoting complex/cyclosome: APC/C. J Cell Sci. 119 (12), 2401-2404 (2006).
- Zhu, X., Chang, K. -. H., He, D., Mancini, M. A., Brinkley, W. R., Lee, W. -. H. The C-terminus of mitosin is essential for its nuclear localization, centromere/kinetochore targeting, and dimerization. J Biol Chem. 270 (33), 19545-19550 (1995).
- Liao, H., Winkfein, R. J., Mack, G., Rattner, J. B., Yen, T. J. CENP-F is a protein of the nuclear matrix that assembles onto kinetochores at late G2 and is rapidly degraded after mitosis. J Cell Biol. 130 (3), 507-518 (1995).
- Rattner, J. B., Rao, A., Fritzler, M. J., Valencia, D. W., Yen, T. J. CENP-F is a ca 400 kDa kinetochore protein that exhibits a cell-cycle dependent localization. Cell Motil Cytoskeleton. 26 (3), 214-226 (1993).
- Christie, M., Chang, C. -. W., Rona, G., Smith, K. M., Stewart, A. G., Takeda, A. A. S., Fontes, M. R. M., Stewart, M., Vertessy, B. G., Forwood, J. K., Kobe, B. Structural biology and regulation of protein import into the nucleus. J Mol Biol. 428 (10A), 2060-2090 (2016).
- Zuccolo, M., Alves, A., Galy, V., Bolhy, S., Formstecher, E., Racine, V., Sibarita, J. B., Fukagawa, T., Shiekhattar, R., Yen, T., Doye, V. The human Nup107/160 nuclear pore subcomplex contributes to proper kinetochore functions. EMBO J. 26, 1853-1864 (2007).
- Bolhy, S., Bouhlel, I., Dultz, E., Nayak, T., Zuccolo, M., Gatti, X., Vallee, R., Ellenberg, J., Doye, V. A Nup133-dependent NPC-anchored network tethers centrosomes to the nuclear envelope in prophase. J Cell Biol. 192 (5), 855-871 (2011).
- Hu, D. J., Baffet, A. D., Nayak, T., Akhmanova, A., Doye, V., Vallee, R. B. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154 (6), 1300-1313 (2013).
- Vergnolle, M. S., Taylor, S. S. Cenp-F links kinetochores to Ndel1/Nde1/Lis1/Dynein microtubule motor complexes. Curr Biol. 17 (13), 1173-1179 (2007).
- Yang, Z. Y., Guo, J., Li, N., Qian, M., Wang, S. N., Zhu, X. L. Mitosin/CENP-F is a conserved kinetochore protein subjected to cytoplasmic dynein-mediated poleward transport. Cell Res. 13 (4), 275-283 (2003).
- Yang, Z., Guo, J., Chen, Q., Ding, C., Du, J., Zhu, X. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25 (10), 4062-4074 (2005).
- Xue, Y., Ren, J., Gao, X., Jin, C., Wen, L., Yao, X. GPS 2.0, a tool to predict kinase-specific phosphorylation sites in hierarchy. Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1598-1608 (2008).
- Song, C., Ye, M., Liu, Z., Cheng, H., Jiang, X., Han, G., Songyang, Z., Tan, Y., Wang, H., Ren, J., Xue, Y., Zou, H. Systematic analysis of protein phosphorylation networks from phosphoproteomic data. Mol Cell Proteomics. 11 (10), 1070-1083 (2012).
- UniProt-Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D158-D169 (2017).
- Olsen, J. V., Vermeulen, M., Santamaria, A., Kumar, C., Miller, M. L., Jensen, L. J., Gnad, F., Cox, J., Jensen, T. S., Nigg, E. A., Brunak, S., Mann, M. Quantitative phosphoproteomics reveals widespread full phosphorylation site occupancy during mitosis. Science Signal. 3 (104), ra3 (2010).
- Dephoure, N., Zhou, C., Villén, J., Beausoleil, S. A., Bakalarski, C. E., Elledge, S. J., Gygi, S. P. A quantitative atlas of mitotic phosphorylation. Proc Natl Acad of Sci U S A. 105 (31), 10762-10767 (2008).
- Rona, G., Marfori, M., Borsos, M., Scheer, I., Takacs, E., Toth, J., Babos, F., Magyar, A., Erdei, A., Bozoky, Z., Buday, L., Kobe, B., Vertessy, B. G. Phosphorylation adjacent to the nuclear localization signal of human dUTPase abolishes nuclear import: structural and mechanistic insights. Acta Cryst D. 69 (12), 2495-2505 (2013).
- Harreman, M. T., Kline, T. M., Milford, H. G., Harben, M. B., Hodel, A. E., Corbett, A. H. Regulation of nuclear import by phosphorylation adjacent to nuclear localization signals. J Biol Chem. 279 (20), 20613-20621 (2004).
- Kosugi, S., Hasebe, M., Tomita, M., Yanagawa, H. Systematic identification of cell cycle-dependent yeast nucleocytoplasmic shuttling proteins by prediction of composite motifs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10171-10176 (2009).
- McLachlin, D. T., Chait, B. T. Analysis of phosphorylated proteins and peptides by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 5 (5), 591-602 (2001).
- Van Berkel, G. J., Glish, G. L., McLuckey, S. A. Electrospray ionization combined with ion trap mass spectrometry. Anal Chem. 62 (13), 1284-1295 (1990).
- Hodel, A. E., Harreman, M. T., Pulliam, K. F., Harben, M. E., Holmes, J. S., Hodel, M. R., Berland, K. M., Corbett, A. H. Nuclear localization signal receptor affinity correlates with in vivo localization in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 281 (33), 23545-23556 (2006).
- Hong, K. U., Kim, H. -. J., Kim, H. -. S., Seong, Y. -. S., Hong, K. -. M., Bae, C. -. D., Park, J. Cdk1-Cyclin B1-mediated Phosphorylation of Tumor-associated Microtubule-associated Protein/Cytoskeleton-associated Protein 2 in Mitosis. J Biol Chem. 284 (24), 16501-16512 (2009).
- Meraldi, P., Lukas, J., Fry, A. M., Bartek, J., Nigg, E. A. Centrosome duplication in mammalian somatic cells requires E2F and Cdk2–Cyclin A. Nature Cell Biol. 1, 88 (1999).
- Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
- Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding Tag, a New Tool to Visualize Phosphorylated Proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
- Takeda, H., Kawasaki, A., Takahashi, M., Yamada, A., Koike, T. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of phosphorylated compounds using a novel phosphate capture molecule. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (18), 2075-2081 (2003).
- Linder, M. I., Köhler, M., Boersema, P., Weberruss, M., Wandke, C., Marino, J., Ashiono, C., Picotti, P., Antonin, W., Kutay, U. Mitotic Disassembly of Nuclear Pore Complexes Involves CDK1- and PLK1-Mediated Phosphorylation of Key Interconnecting Nucleoporins. Dev Cell. 43 (2), (2017).
- Arai, T., Haze, K., Iimura-Morita, Y., Machida, T., Iida, M., Tanaka, K., Komatani, H. Identification of β-catenin as a novel substrate of polo-like kinase 1. Cell Cycle. 7 (22), 3556-3563 (2008).
- Hansen, D. V., Tung, J. J., Jackson, P. K. CaMKII and Polo-like kinase 1 sequentially phosphorylate the cytostatic factor Emi2/XErp1 to trigger its destruction and meiotic exit. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103 (3), 608-613 (2006).
- Zhang, Y., Dong, Z., Nomura, M., Zhong, S., Chen, N., Bode, A. M., Dong, Z. Signal Transduction Pathways Involved in Phosphorylation and Activation of p70S6K Following Exposure to UVA Irradiation. J Biol Chem. 276 (24), 20913-20923 (2001).
- Richard, D. E., Berra, E., Gothié, E., Roux, D., Pouysségur, J. p42/p44 Mitogen-activated Protein Kinases Phosphorylate Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) and Enhance the Transcriptional Activity of HIF-1. J Biol Chem. 274 (46), 32631-32637 (1999).
