Cyclin के आश्रित कळेनासे 1 विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान एक इन विट्रो कळेनासे परख
Summary
Cyclin-निर्भर कळेनासे 1 (Cdk1) कोशिका चक्र के G2 चरण में सक्रिय है और कई सेलुलर रास्ते नियंत्रित करता है । यहां, हम Cdk1, जो इस महत्वपूर्ण कळेनासे के सेलुलर लक्ष्य स्थापित करने के लिए Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान की अनुमति देता है के साथ एक इन विट्रो कळेनासे परख के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद ।
Abstract
Cyclin-निर्भर कळेनासे 1 (Cdk1) सभी eukaryotes में सेल चक्र के लिए एक मास्टर नियंत्रक है और phosphorylates एक अनुमानित 8-13% proteome; हालांकि, विशेष रूप से मानव कोशिकाओं में Cdk1 के लिए पहचान लक्ष्यों की संख्या अभी भी कम है । Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान महत्वपूर्ण है, के रूप में वे यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान कैसे Cdk1 कोशिका चक्र को नियंत्रित करता है । सेल चक्र विनियमन वफादार गुणसूत्र अलगाव के लिए महत्वपूर्ण है, और इस जटिल प्रक्रिया में दोष गुणसूत्र विचलन और कैंसर के लिए नेतृत्व ।
यहां, हम इन विट्रो कळेनासे परख है कि Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है का वर्णन । इस परख में, एक शुद्ध प्रोटीन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव Cdk1 द्वारा इन विट्रो में phosphorylated है/cyclin बी सफल फास्फारिलीकरण एसडीएस द्वारा पुष्टि की है-पृष्ठ, और फास्फारिलीकरण साइटों को बाद में जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान कर रहे हैं । हम भी शुद्धि प्रोटोकॉल है कि उच्च शुद्ध और सजातीय प्रोटीन कळेनासे परख के लिए उपयुक्त तैयार उपज का वर्णन है, और फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान की कार्यात्मक सत्यापन के लिए एक बाध्यकारी परख है, जो के बीच बातचीत की जांच एक शास्त्रीय परमाणु स्थानीयकरण संकेत (cNLS) और उसके परमाणु परिवहन रिसेप्टर karyopherin α. प्रयोगात्मक डिजाइन के साथ सहायता करने के लिए, हम प्रोटीन दृश्यों से Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की भविष्यवाणी के लिए दृष्टिकोण की समीक्षा करें । एक साथ इन प्रोटोकॉल एक बहुत शक्तिशाली दृष्टिकोण है कि पैदावार Cdk1 विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों और यंत्रवत अध्ययन में सक्षम बनाता है कैसे Cdk1 कोशिका चक्र को नियंत्रित करता है । इस विधि के बाद से शुद्ध प्रोटीन पर निर्भर करता है, यह किसी भी मॉडल जीव और पैदावार विश्वसनीय परिणाम के लिए लागू किया जा सकता है, खासकर जब सेल कार्यात्मक अध्ययन के साथ संयुक्त ।
Introduction
Kinases कि एंजाइमों सब्सट्रेट पर एटीपी से फॉस्फेट समूहों हस्तांतरण और कई सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित कर रहे हैं. इस फास्फारिलीकरण प्रतिवर्ती है, तेजी से, दो नकारात्मक शुल्क कहते हैं, और मुक्त ऊर्जा भंडार है, और सबसे आम posttranslational कोशिकाओं द्वारा इस्तेमाल संशोधनों में से एक है । Cdk1, जो भी कोशिका विभाजन चक्र प्रोटीन 2 homolog (cdc2) के रूप में जाना जाता है सभी eukaryotes1,2,3,4,5, और phosphorylates एक में सेल चक्र के लिए एक मास्टर नियंत्रक है proteome6,7का अनुमानित 8-13% ।
जबकि हाल के proteomic अध्ययनों में प्रोटीन में कई फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान की है, ज्यादातर मामलों में, इन संशोधनों के लिए जिंमेदार कळेनासे अज्ञात है । ज्ञात Cdk1 लक्ष्य की संख्या, विशेष रूप से मानव कोशिकाओं में कम है7. Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह यंत्रवत अध्ययन है कि स्थापित कैसे Cdk1 कोशिका चक्र को नियंत्रित करता है सक्षम बनाता है । सेल चक्र विनियमन वफादार गुणसूत्र अलगाव और कोशिका विभाजन के लिए महत्वपूर्ण है, और सेलुलर प्रक्रियाओं के असंख्य के लिए इस महत्वपूर्ण शारीरिक समारोह का समर्थन करने के लिए होने की जरूरत है । इस जैसे परमाणु लिफाफा, गुणसूत्र संघनित्र के विधानसभा, और mitotic धुरी विधानसभा का बँटवारा, के रूप में अच्छी तरह के रूप में सेलुलर संरचना और संगठन में एक नाटकीय पुनर्गठन के शुरू होने से पहले प्रतिलेखन और अनुवाद रोकने शामिल हैं । इन प्रक्रियाओं में विनियमन और त्रुटियों के कारण कैंसर, जंम दोष, या mitotic कोशिका मृत्यु । इस तरह के आरओ के रूप में Cdk1 के विशिष्ट अवरोधकों-३३०६ विकसित किए गए थे8, जो कार्यात्मक अध्ययन के लिए शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं, और इन अवरोधकों में से कुछ वर्तमान में कैंसर के उपचार के लिए नैदानिक परीक्षणों में कर रहे हैं (समीक्षा के लिए9 देखें).
यहां, हम इन विट्रो कळेनासे परख कि Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान की अनुमति देता है में एक का वर्णन । इस परख में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव Cdk1/cyclin B को phosphorylate करने के लिए प्रयोग किया जाता है इन विट्रो मेंएक शुद्ध लक्ष्य प्रोटीन । एक सब्सट्रेट के फास्फारिलीकरण अपने द्रव्यमान बढ़ जाती है और दो नकारात्मक शुल्क कहते हैं; इसलिए, सफल फास्फारिलीकरण एसडीएस-पृष्ठ पर प्रोटीन जेल बैंड की एक ऊपर की ओर बदलाव से पुष्टि की है । Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटें बाद में मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण द्वारा की पहचान की जाती है इन विट्रो phosphorylated प्रोटीन । प्रयोगात्मक डिजाइन के साथ सहायता करने के लिए, हम भी गणना उपकरण और प्रोटीन अनुक्रम से Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की भविष्यवाणी के लिए संदर्भ की समीक्षा करें । इसके अलावा, हम भी शुद्धि प्रोटोकॉल है कि उच्च शुद्ध और सजातीय प्रोटीन कळेनासे परख के लिए उपयुक्त तैयारी उपज का वर्णन । अंत में, की पहचान की फास्फारिलीकरण साइटों कार्यात्मक अध्ययन द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए, और एक सरल बाध्यकारी परख यहां वर्णित है कि प्रयोजन के लिए । संयुक्त, यह एक बहुत शक्तिशाली दृष्टिकोण है कि पैदावार Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों और कैसे Cdk1 सेल चक्र7,10,11नियंत्रण में यंत्रवत अध्ययन में सक्षम बनाता है । इस विधि के बाद से शुद्ध प्रोटीन पर निर्भर करता है, यह किसी भी मॉडल जीव और पैदावार विश्वसनीय परिणाम के लिए लागू किया जा सकता है । हालांकि, इन विट्रो में प्राप्त फास्फारिलीकरण साइटों के कार्यात्मक सत्यापन की सिफारिश की है, के रूप में कोशिकाओं के स्थान पर अतिरिक्त विनियामक तंत्र, जैसे posttranslational संशोधनों, संपर्क भागीदारों, या सेलुलर स्थानीयकरण है कि Cdk1 द्वारा मांयता के लिए पहुंच योग्य या पहुंच योग्य फास्फारिलीकरण साइट्स रेंडर कर सकते हैं ।
Cdk1 एक आम सहमति फास्फारिलीकरण साइट है कि (Ser/-प्रो एक्स-Lys/Arg), जहां एक्स किसी भी अवशेषों और एक serine या threonine है के होते है पहचानता फास्फारिलीकरण की साइट है । मांयता के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण + 1 स्थिति में पंक्ति की उपस्थिति है । इसके अलावा, बुनियादी अवशेषों में + 3 स्थिति6,12पर एक Lys या Arg युक्त सबसे Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों के साथ + 2 या 3 पदों, में पसंद कर रहे हैं ।
Cdk1 के सक्रियकरण कसकर विनियमित है और बँटवारा1,2,3,4,5की शुरुआत की ओर जाता है । सामांय में cyclin-निर्भर kinases की गतिविधि अलग cyclins (cyclin A, B, C, D, और मनुष्यों में ई) के साथ उनके सहयोग पर निर्भर करती है, जो कोशिका चक्र13भर में दोलन स्तर पर व्यक्त किए जाते हैं । Cdk1 अभिव्यक्ति सेल चक्र के पार स्थिर है और अपनी गतिविधि के विनियमन विनियामक उपइकाइयों cyclin एक और cyclin बी5,13,14,15के साथ अपने सहयोग पर निर्भर करता है, के रूप में अच्छी तरह से पोस्ट-शोधों संशोधनों के रूप में । Cdk1/cyclin बी कॉंप्लेक्स के गठन कळेनासे सक्रियण के लिए आवश्यक है5,14,15,16,17,18। G2 चरण में, cyclin B cytosol में अनुवादित की गई है और नाभिक में आयात किया जाता है जहां यह Cdk1 के लिए बाइंड कर देता है5,14,15,16,17,18; तथापि, Cdk1/cyclin ख के अवशेषों पर फास्फारिलीकरण द्वारा निष्क्रिय ठहराया जाता है Thr14 और Tyr15 द्वारा मानव Cdk1-निरोधात्मक kinases Myt1 (झिल्ली-संबद्ध tyrosine-और threonine-विशिष्ट cdc2-निरोधात्मक कळेनासे) और Wee1, क्रमशः19, 20,21. देर से G2 चरण में, सेल डिवीजन चक्र 25 फॉस्फेट (cdc25) द्वारा Thr14 और Tyr15 के dephosphorylation कळेनासे/Cdk1 बी परिसर के cyclin गतिविधि को सक्रिय करता है और बँटवारा12,14की दीक्षा से चलाता है, 18 , 20 , 22 , 23. Thr161 के फास्फारिलीकरण भी Cdk1/cyclin बी सक्रियण के लिए आवश्यक है और Cdk7 द्वारा मध्यस्थता है, Cdk-सक्रिय कळेनासे (कैक)18. anaphase में cyclin बी का क्षरण Cdk1 को निष्क्रिय करता है, बँटवारा२४,२५से बाहर निकलने की अनुमति. Cdk1/cyclin B के सक्रियकरण इसलिए एक जटिल प्रक्रिया है । प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Cdk1/cyclin बी के साथ किया जाता है । कीट कोशिकाओं में इस परिसर की रिकॉमबिनेंट अभिव्यक्ति के दौरान, यह अंतर्जात kinases14,20 द्वारा vivo में सक्रिय है और शुद्ध राज्य में सक्रिय रहता है । जिसके परिणामस्वरूप सक्रिय, रिकॉमबिनेंट मानव Cdk1/cyclin B के लिए उपयुक्त है इन विट्रो कळेनासे परख ।
यहां, हम मानव centromere प्रोटीन एफ में Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन (CENP-f)10। CENP-F एक kinetochore प्रोटीन है कि एक के दौरान नाभिक में रहता है (G1 और एस चरण) और G2 चरण में cytosol के लिए निर्यात किया जाता है26,27,28 एक Cdk1-निर्भर तरीके से10, 11. नाभिकीय स्थानीयकरण एक द्विपक्षीय cNLS26द्वारा संमानित किया गया है । cNLSs परमाणु परिवहन कारक karyopherin α, जो karyopherin β और RanGDP, cNLS-कार्गो के नाभिक में29के आयात के साथ की सुविधा के द्वारा मांयता प्राप्त कर रहे हैं । G2 के चरण में परमाणु निर्यात एक अज्ञात निर्यात मार्ग10के माध्यम से सुविधा है । एक बार CENP-एफ cytosol में रहता है, यह परमाणु लिफाफे में भर्ती है और बदले में मोटर प्रोटीन जटिल dynein30,31भर्ती । इस मार्ग में एक dynein-निर्भर तरीके से mitotic धुरी विधानसभा के प्रारंभिक चरणों के दौरान centrosome करने के लिए संबंधित नाभिक की स्थिति के लिए महत्वपूर्ण है, जो mitotic प्रविष्टि के सही समय के लिए और मस्तिष्क में एक मौलिक प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है विकास30,31,३२. G2 चरण में शुरू, CENP-F भी kinetochore में इकट्ठे हुए है जहां यह वफादार गुणसूत्र अलगाव के लिए महत्वपूर्ण भूमिका है27,28,३३,३४,३५ . इन रास्ते का एक महत्वपूर्ण नियामक कदम CENP के परमाणु निर्यात-G2 चरण में एफ, जो Cdk110,11पर निर्भर है । हम यहां CENP के cNLS में Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन एफ । इन साइटों के Phosphomimetic उत्परिवर्तनों CENP के परमाणु आयात-एफ नीचे धीमी, सुझाव है कि Cdk1/cyclin बी सीधे CENP के सेलुलर स्थानीयकरण को नियंत्रित करता है-फास्फारिलीकरण द्वारा अपने cNLS10के एफ ।
कुल मिलाकर, इस में इन विट्रो कळेनासे परख कळेनासे Cdk1 के लिए विशिष्ट सब्सट्रेट की पहचान की अनुमति देता है. शुद्ध लक्ष्य प्रोटीन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Cdk1 द्वारा इन विट्रो में phosphorylated कर रहे हैं/cyclin बी कॉंप्लेक्स और फास्फारिलीकरण साइटें बाद में जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाने जाते हैं. Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान यंत्रवत अध्ययनों का समर्थन करता है जो पता चलता है कि कोशिका चक्र को कैसे Cdk1 नियंत्रित करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे इन विट्रो कळेनासे परख एक बहुत शक्तिशाली तरीका कळेनासे Cdk1 है, जो सेल चक्र के एक मास्टर नियंत्रक है और कई महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है के लिए आणविक लक्ष्यों की पहचान है । व?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ डेविड किंग, हावर्ड ह्यूजेस चिकित्सा संस्थान, कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण और उपयोगी टिप्पणियों के लिए बर्कले में धंयवाद । हम Dr. Xuelian झू, शंघाई, जैव विज्ञान के लिए संस्थानों, चीनी विज्ञान अकादमी, शंघाई, चीन के लिए एक पूर्ण लंबाई CENP-च निर्माण प्रदान करने के लिए धंयवाद । अंत में, हम dr. Susan बने, डॉ ब्रायन Callahan और डॉ Christof ग्रेवाल Binghamton विश्वविद्यालय में उपकरणों तक पहुंच के लिए धंयवाद । यह शोध ंयूयॉर्क के राज्य विश्वविद्यालय के लिए अनुसंधान फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था और रसायन विज्ञान विभाग, Binghamton में ंयूयॉर्क के राज्य विश्वविद्यालय ।
Materials
| 2800 ml baffled Fernbach flask | Corning | 44232XL | |
| ampicillin | Gold Biotechnology | A-301-25 | |
| ATP | Fisher Scientfiic | BP413-25 | |
| benzamidine hydrochloride | Millipore Sigma | B6506-25 | |
| bottletop filter | Corning | 431161 | |
| Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL | New England Biolabs | P6020 | |
| Cdk1/cyclin B (alternate source) | EMD Millipore | 14-450 | |
| Cdk1/cyclin B (alternate source) | Invitrogen | PV3292 | |
| Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer | New England Biolabs | P6020 | |
| CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid | Available upon request. | ||
| centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor | Thermo Scientific | 10033-778 | |
| centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes | EMD Millipore | UFC900324 | |
| chlorampenicol | Gold Biotechnology | C-105-100 | |
| D/L methionine | Agros Organics / Fisher | 125650010 | |
| desalting pipet tips: Zip tips | Millipore Sigma | ZTC18S008 | |
| disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm | Biorad | 7321010 | |
| dithiothreitol | Gold Biotechnology | DTT50 | |
| E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain | EMD Millipore | 71403 | |
| electrospray ionization Fourier transform ion | Bruker Amazon | Apex III | |
| cyclotron resonance mass spectrometer | |||
| electrospray ionization ion trap mass spectrometer | Bruker Amazon | custom | |
| fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy | Thermo Scientific | 97040-276 | |
| FPLC system: Äkta Pure FPLC | GE Healthcare | 29032697 | |
| Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| glutathione agarose | Pierce | 16101 | |
| glutathione, reduced | Millipore Sigma | G4251-50g | |
| incubation shaker: multitron shaker | Infors | I10102 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
| kanamycin | Gold Biotechnology | K-120-25 | |
| karyopherin α pet-28a pres plasmid | Available upon request. | ||
| Luria Bertani medium | Fisher Scientfiic | BP1426-2 | |
| microcentrifuge 5418R, refrigerated | Eppendorf | 5401000013 | |
| microtubes (0.5 ml) | Eppendorf | 30121023 | |
| microtubes (1.5 ml) | Eppendorf | 30120086 | |
| Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel | Millipore Sigma | P6611-100ml | |
| pGEX-6P-1 plasmid | Millipore Sigma | GE28-9546-48 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Gold Biotechnology | P470-10 | |
| PS protease: PreScission protease | GE Healthcare | 27084301 | |
| Phos-tag acrylamide | Wako Pure Chem. Ind. | 304-93521 | |
| reduced gluthathione | Millipore Sigma | G4251-50g | |
| roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes) | Fisher Scientfiic | 055291D | |
| site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning | Agilent | 210518 | |
| Site-Directed Mutagenesis Kit | |||
| sonifier: Branson S-250D sonifier | Branson | 15 338 125 | |
| Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff) | Spectrum Labs | 08 670B | |
| swing out rotor TX-1000 | Thermo Scientific | 10033-778 |
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