Denne protokol beskriver metoder til mundtligt udsætte og inficere frugtflue Drosophila melanogaster med bakterielle patogener, og til at måle antallet af smitsomme bakterier skur efter tarm infektion. Vi yderligere at beskrive virkningen af immun mutanter på flyve overlevelse efter mundtlig bakteriel infektion.
Bananfluen Drosophila melanogaster er en af de bedste udviklede modelsystemer af infektion og medfødt immunitet. Mens de fleste arbejde har fokuseret på systemiske infektioner, har der været en nylig stigning af interesse i mekanismerne i gut immunocompetence til patogener, som kræver metoder til mundtligt inficere fluer. Her præsenterer vi en protokol for at oralt udsætte enkelte fluer til en opportunistisk bakteriel patogen (Pseudomonas aeruginosa) og en naturlig bakteriel patogen af D. melanogaster (Pseudomonas entomophila). Målet med denne protokol er at give en robust metode til at afsløre mandlige og kvindelige fluer til disse patogener. Vi give repræsentative resultater viser overlevelse fænotyper, mikrobe belastninger og bakteriel udgydelse, som er relevante for undersøgelsen af heterogenitet i patogen transmission. Endelig vil vi bekræfte, at Dcy mutanter (mangler den beskyttende peritrophic matrix i tarm epitel) og Relish mutanter (mangler en funktionel immundefekt (IMD) pathway), vise øget følsomhed over for mundtlig bakterieinfektion. Denne protokol beskriver derfor en robust metode til at inficere fluer ved den mundtlige vej, infektion, som kan udvides til at omfatte undersøgelse af en række genetiske og miljømæssige kilder til variation i tarm infektion resultater og bakteriel overførsel.
Bananfluen (også kendt som eddike flyve), D. melanogaster, har været flittigt brugt som en model organisme for infektion og immunitet mod en bred vifte af patogener1,2. Dette arbejde har tilbudt grundlæggende indsigt i de fysiologiske konsekvenser af infektion og var også banebrydende i optrævler de molekylære veje underliggende vært immunrespons mod snylter, bakterier, svampe og virale infektioner. Denne viden er ikke kun nyttig til at forstå det medfødte immunresponset af insekter og andre hvirvelløse dyr, men fordi mange af de immun mekanismer er evolutionært bevaret mellem insekter og pattedyr, Drosophila også har ansporet opdagelsen af større immun mekanismer i pattedyr, herunder mennesker3.
De fleste arbejde på Drosophila infektion og immunitet har fokuseret på systemiske infektioner, ved hjælp af podning metoder, der leverer patogener direkte ind i kroppen af insektet af prikkende eller injektion4,5,6. Fordelen ved disse metoder i muliggør levering af en kontrolleret infektiøse dosis er klar og understøttet af en omfattende arbejde på systemiske infektioner. Dog er mange naturligt forekommende bakterielle patogener af D. melanogaster erhvervet gennem fodring på rådnende organisk materiale hvor gut immunocompetence spiller en væsentlig rolle i vært forsvar7,8,, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. eksperimenter, der beskæftiger systemiske infektioner omgå disse forsvarsværker, og derfor giver et helt andet billede af hvordan insekter montere forsvar mod naturlige patogener. Dette er især relevant, hvis formålet med arbejdet er at teste forudsigelser om økologi og udviklingen i infektion, hvor brugen af naturlige patogener og ruter for infektion er vigtigt16,17. Seneste arbejde har fremhævet, hvordan ruten taget af patogener væsentligt påvirker sygdommen resultatet18,19, fremkalder forskellige immun veje20,21, kan fastslå den beskyttende effekt af arvet endosymbionts16, og kan endda spille en vigtig rolle i udviklingen af vært forsvar17.
En anden grund til at ansætte mundtlig ruter af infektion er, at det giver undersøgelsen af variationen i patogen transmission ved måling af bakteriel udgydelse under fækal udskillelse efter oral infektion22,23, 24. forståelse kilder til vært heterogenitet i smitteoverførsel udfordrende i naturlige populationer25,26, men måling af komponenter af transmission, såsom patogen udgydelse, under kontrollerede laboratorium betingelser tilbyder en nyttig alternativ tilgang27. Ved fodring fluer bakterier og måle bakteriel udgydelse under en række af genetiske og miljømæssige sammenhænge i kontrolleret forsøgsbetingelser, er det muligt at identificere kilder til variation i lysgennemstrømningen blandt værter.
Her, vi beskriver en protokol for mundtligt inficerer D. melanogaster med bakterielle patogener, og til kvantificering af bakterievækst og udgyde som følger (figur 1). Vi beskriver denne protokol på to Pseudomonas -bakterier: en ondartet stamme af den opportunistisk patogen P. aeruginosa (PA14), og en mindre ondartet stamme af naturligt flyve patogen P. entomophila. Pseudomonads er fælles gram-negative bakterier med en bred værtsspektrum, inficere insekter, nematoder, planter og hvirveldyr, og som findes i de fleste miljøer4,6. Enterisk infektion i Drosophila af P. aeruginosa og P. entomophila resulterer i patologi til tarm epitheler12,13,14,15, 28. Mens vi fokus på disse to bakterielle patogener, kan de metoder, der beskrives her principielt anvendes på enhver bakteriel patogen interesse med mindre ændringer. Efter oral eksponering, vi måle efter infektionen overlevelse, og måle mikrobe belastning inden for enkelte fluer og levedygtige mikrober kaste ud i miljøet, udtrykt i kolonidannende enheder (CFUs). Endelig, da gut immunocompetence resultater fra en kombination af epitel barriere og humorale svar, vi også måle overlevelse flyve linjer hvor disse forsvarsværker er forstyrret. Specifikt, Drosocrystallin (Dcy) mutanter har tidligere vist sig at være mere modtagelige for mundtlige bakteriel infektion på grund af en forarmet peritrophic matrix i gut29. Vi måler også overlevelse i en Relish (Rel) mutant, der er forhindret i at producere antimikrobielle peptider mod Gram-negative bakterier via IMD pathway30.
Vi præsenterer en protokol til at pålideligt mundtligt inficere D. melanogaster med bakterielle patogener. Vi fokuserer på P. aeruginosa og P. entomophila, men denne protokol kan nemt tilpasses aktiverer infektion af andre bakteriearter, fx, Serratia marcescens7. Vigtige aspekter af denne protokol vil variere mellem bakteriearter. Derfor, den mest effektive infektiøse dosis, tilsvarende virulens og vært genotype modtagelighed bør alle betragtes og ideelt testet i pilotundersøgelserne. Udsætte fluer til bakteriel kulturer af en vifte af optiske tætheder og måle deres infektiøse dosis og overlevelse er et passende udgangspunkt, når du arbejder med nye bakteriearter eller flyve linjer.
Protokollen skridt såsom flyve sult inden fodring og re suspendere bakteriel pellets i 5% rørsukkeropløsning er hverdagskost i oral infektion og øge pålideligheden af bakteriel infektion under eksponering7,8, 9 , 10. det er imidlertid vigtigt at bemærke, at under eksponeringen, fluer hovedsagelig live på en overflade af bakteriekulturen. Ved at gå på denne kultur, vil bakterier blive indgivet på den flue overflade, især på hårstrået eller omkring børster24. Disse epicuticular bakterier, afspejler ikke en vellykket enterisk infektion men ville stadig blive opdaget af flyve homogenisering og plating. For at mindske risikoen for falske positiver, er det vigtigt at overfladen sterilisere fluer gennem fordybelse i 70% ethanol i op til 1 minut.
Når man overvejer bakteriel shedding satser, er oral infektion afgørende. Antallet af patogener en vært udslip i miljøet er ofte vanskeligt at måle og den interne belastning er ofte taget som en proxy for sværhedsgraden af infektion og derfor transmission26,27. Måling bakteriemængde sammen med bakteriel udgydelse giver mulighed for en undersøgelse af forholdet mellem disse to vigtige komponenter i sygdom sværhedsgraden og opslag38. En begrænsning af metoden præsenteret er, at aflæst den interne bakteriemængde på fluer kræver destruktiv prøvetagning. Dette gør det vanskeligt at undersøge langsgående tendenser af patogenet vækst og clearance inden for samme individ. Det er dog muligt at overvinde denne begrænsning af destruktivt prøveudtagning kohorter af personer på forskellige stadier af infektion, under forudsætning af, at den gennemsnitlige mikrobe belastning i hver kohorte afspejler den langsgående patogen dynamik inden for et givet enkelte. Bakteriel udgydelse ikke lider af de samme begrænsninger, og vi giver eksempler på hvordan udgydelse kan kvantificeres i en tværsnitsstikprøven, eller på langs til at undersøge, hvordan udgydelse ændringer inden for individ over tid.
Mange vært og patogen træk afgøre i fællesskab en persons tilbøjelighed til at overføre sygdommen25,26,39. Mens betydningen af disse træk sandsynligvis varierer mellem vært-patogen systemer, er udgyde sandsynligvis en vigtig faktor for fækal-oral transmission. Evnen til at måle bakteriel udgydelse åbner mulighed for at teste denne antagelse. Har karakteriseret vært-patogen dynamics i en ønskede panel af flyve linjer, kunne eksperimentatorer mundtligt inficere individer og placere dem ved siden af ikke-inficerede, modtagelige værter i deres smitsomme perioder. Disse ‘modtagende’ fluer kunne derefter analyseres for interne bakteriemængde på forskellige tidspunkter som en måde at måle direkte transmission.
Dette arbejde blev støttet af en strategisk award fra Wellcome Trust for centret for immunitet, infektion og Evolution (http://ciie.bio.ed.ac.uk; grant reference nr. 095831). PFV blev støttet af en Branco Weiss fellowship (https://brancoweissfellowship.org/) og en kansler Fellowship (School of Biological Sciences, University of Edinburgh); JASJ blev støttet af en NERC E3 DTP PhD studentship.
Vials | Sarstedt Ltd. | 58.490 | Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml |
Agar | Sigma-Aldrich | A7002 | Agar, ash 2.0-4.5% |
Brown sugar | Bidvest | 66032 | Light brown soft sugar |
Maize | Dove's Farm | Organic maize flour | |
Fermipan yeast | Bidvest | 96360 | Dry, instant yeast |
Methyl-4-hydroxybenzoate | Sigma-Aldrich | H5501 | >=99.0%, crystalline |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Sucrose BioUltra, for molecular biology, >=99.5% (HPLC) |
Petri dishes | Fisher Scientific UK Ltd. | 15788517 | X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent |
Falcon tubes (50ml) | Greiner Bio-one Inc | 210261 | Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile |
Eppendorf tube (0.5ml) | Sarstedt Ltd. | 72.699 | Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral |
Eppendorf tube (1.5ml) | Sarstedt Ltd. | 72.690.001 | Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral |
Ethanol | VWR International Ltd. | 20821.33 | ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE – Analytical Grade |
2 L Conical Flask | VWR International Ltd. | 214-0038 | Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask |
Sterile filter paper | Fisher Scientific UK Ltd. | 1001-020 | Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm |
Bijou sample container | Fisher Scientific UK Ltd. | 129A | 7ml polystyrene sample container |
Pseudomonas isolation agar | Sigma-Aldrich | 17208 | Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L |
LB broth, Miller | Fisher Scientific UK Ltd. | BP1426 | Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre |
Large Embryo Collection Cages | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | 59-101 | Flystuff- fits 100mm petri dish |
TRI reagent solution | Life Technologies | AM9738 | |
96-well microplate | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | 353072 | Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile |
Pestle | Fisher Scientific UK Ltd | 12649595 | Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk |
Glycerol | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | CHE2068 | Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L |
Cotton wool- non absorbent | Cowens Ltd | ABL | Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500 |
Cotton wool- absorbent | Cowens Ltd | ABS | BP small quantity 20 bags x 500 |
Vortex | Fisherbrand | Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V | |
Orbital incubator | Gallenkamp | INR-200-010V | 220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70ºC. Shaking frequency: 0…400 rpm. |
Absorbance Microplate Reader | Biotek Instruments Ltd | ELx808™ Absorbance Microplate Reader | |
Gen 5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek Instruments Ltd | For Absorbance Microplate Reader | |
Centrifuge | Beckman Coulter | 392304 | Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V |
Step One Plus Real Time qPCR System | Thermofisher Scientific | 4376600 | Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system |
Step One Software 2.3 | Thermofisher Scientific | For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems | |
R Statistical Software | https://cran.r-project.org/ | ||
10 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741015 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
200 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741065 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
1000 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741045 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
20 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 774288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs |
200 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 739288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs |
1000 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 740288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs |