Enrichissement et la caractérisation des tumeur immunitaire et Non immuns micro-environnements dans les tumeurs murines sous-cutanée établis

Summary

Nous décrivons ici une méthode pour séparer et enrichir les composants du microenvironnement tumoral immunitaire et non immuns dans les tumeurs sous-cutanées établies. Cette technique permet l’analyse distincte d’infiltrat immunitaire de tumeur et fractions de tumeur non immuns qui peuvent permettre la caractérisation complète du microenvironnement immunitaire de la tumeur.

Abstract

Microenvironnement immunitaire de tumeur (temps) a récemment été reconnu comme un médiateur essentiel de la réponse au traitement dans les tumeurs solides, surtout pour les immunothérapies. Récents progrès cliniques en immunothérapie soulignent la nécessité de méthodes reproductibles avec précision et bien caractériser la tumeur et son infiltrat immune associée. Digestion enzymatique de tumeur et cytométrie permettent large caractérisation de nombreux sous-ensembles de cellules immunitaires et les phénotypes ; Cependant, profondeur d’analyse est souvent limitée par des restrictions de fluorophore sur planche de bord et la nécessité d’obtenir des échantillons de grande tumeur d’observer les rares populations immunitaires d’intérêt. Ainsi, nous avons développé une méthode efficace et haut débit de séparation et d’enrichir l’infiltrat immunitaire de tumeur des composants non immuns tumeur. La digestion de la tumeur décrit et séparation centrifuge axée sur la densité technique permet distincte caractérisation de la tumeur et tumeur immunitaires infiltrant fractions et préserve la viabilité cellulaire et offre donc une large caractérisation de la tumeur État immunologique. Cette méthode a été utilisée pour caractériser la vaste abri l’hétérogénéité spatiale des tumeurs solides, qui démontre également la nécessité pour les techniques de profilage immunologiques compatibles toute tumeur. Dans l’ensemble, cette méthode fournit une technique efficace et adaptable pour la caractérisation immunologique de sous-cutanée tumeurs murines solides ; à ce titre, cet outil peut servir à mieux caractériser les fonctions immunologiques tumorales ainsi que l’évaluation préclinique de nouvelles stratégies d’immunothérapie.

Introduction

Le temps suppressif a récemment été reconnu comme une caractéristique du cancer et est connu pour jouer un rôle important dans le développement, la progression et la protection des cancers de tumeur solide mais aussi atténuer leur sensibilité à l’immunothérapie¹. Le temps est composé de nombreux sous-ensembles cellulaires et les phénotypes, qui donnent un aperçu critique de l’État immunologique de la tumeur. Ces sous-ensembles immunologiques peuvent être encore divisés en cellules lymphocytaires ou origine myéloïde, qui constituent la majorité des réponses immunitaires innée et adaptative^2,3<....

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) du Baylor College of Medicine.

1. digestion et récolte tumeur

NOTE : Le temps requis pour la récolte est environ 3-5 min/tumeur et le temps nécessaire à la transformation est ~ 1 h + 2-3 min/tumeur.

1. Euthanasier souris par inhalation de dioxyde de carbone et vaporiser chaque souris vers le bas avec l’éthanol à 70 % avant la récolte pour éviter la contamination de cheveux. Chirurgicalement enlever des tumeurs sous-cutanées des souris et faire en sorte que les tumeurs sont exempts de tout contami....

Results

Nos résultats démontrent l’avantage significatif de TIL la séparation des éléments de tumeur non immunisés, comme cela est expliqué dans le protocole. En outre, à l’aide de la méthode décrite, nous démontrons l’hétérogénéité immunologique significative des tumeurs solides établies.

Un problème important avec nombreuses techniques de dissociation de tumeur est la perte de viabilité de l’échantillon, plus souvent en raison des con.......

Discussion

Le temps est composé de molécules et les composants cellulaires diverses et complexes. Récentes indiquent que la caractérisation précise de cet environnement peut fournir une meilleure compréhension de la réussite du traitement ou d’échec et peut même aider à identifier les mécanismes de résistance thérapeutique. Par exemple, intratumorale niveaux croissants de diverses cellules immunosuppresseurs (c.-à-d., MDSCs, les lymphocytes T régulateurs, etc.) peuvent atténuer les réponses immunes effectrices et .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mâle de 6 à 12 semaines C57BL/6 souris	Jackson Laboratory  ;	N/A	Souris utilisées dans nos études tumorales
MEER Lignée cellulaire syngénique de cancer murin	Acquise auprès d’un collaborateur  ;	N/A	E6/E7 Lignée cellulaire de cancer épithélial de l’amygdale amygdale murine  ;
Alcool isopropylique à 70 %  ;	EMD Milipore  ;	PX1840
Kit d’outils chirurgicaux murins	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Nécessite principalement uniquement des ciseaux, une pince à épiler et un scalpel.
Plaque à 24 puits  ;	Denville Scientific Inc.	T1024	Ou n’importe quelle plaque à fond plat à 24 puits.
RPMI-1640 média	Sigma-Aldrich	R0883
Collagénase I  ;	EMD Milipore	234153
Collagenase IV	Worthington Biochemical Corporation	LS004189
DNase I  ;	Sigma-Aldrich	11284932001
Agitateur orbital basse vitesse	BioExpress (fournisseur : Genemate)  ;	S-3200-LS	Ou n’importe quel agitateur orbital.
Incubateur thermorégulateur	Fisher Scientific	13-255-27	Ou tout autre incubateur thermorégulé
FBS	Sigma-Aldrich	F8192
EDTA	AMRESCO	E177
1 mL Pipette et pointes	Eppendorf	13-690-032	Ou toute autre pipette et pointes
40 um Passoires cellulaires	Fisher Scientific	22363547
Tubes à centrifuger de 50 mL	Denville Scientific Inc.	C1062-P
Tubes coniques de 15 mL	Denville Scientific Inc.	C1012
Seringue Luer-Lok de 10 mL sans aiguilles	BD	309604
Lymphoprep Gradient de densité moyen	STEMCELL Technologies	7811
Pipettes de transfert	Denville Scientific Inc.	P7212
Plaques à fond en U à 96 puits	Denville Scientific Inc.
DPBS	Sigma Aldrich  ;	D8573
FoxP3 Ensemble de tampons de coloration du facteur de transcription  ;	ThermoFisher Scientific	00-5523-00	Tampon de perméabilisation fixe/et tampon de perméabilisation
Centrifugeuse thermorégulée	Eppendorf  ;	5810 R Attune
NxT Cytomètre en flux	ThermoFisher Scientific	N/A	Pour le comptage volumétrique cellulaire à 96 puits  ;
Anti-souris anti-rat purifié CD16/CD32 (bloc BD Fc de souris)  ; Cloner 2.4G2  ;	ThermoFisher Scientific	553141	Fc Block
LIVE/DEAD Kit de coloration bleue à cellules mortes fixable, pour l’excitation UV	ThermoFisher Scientific	L34962	Coloration de viabilité fixable
CD45 Anticorps monoclonal (30-F11), APC-eFluor 780	ThermoFisher Scientific	47-0451-80
TCR bêta Anticorps monoclonal (H57-597), APC	ThermoFisher Scientific	17-5961-82
CD8-&alpha ; Anticorps (KT15), PE	Santa Cruz Biotechnology	sc-53473  ;
Anticorps monoclonaux CD4 (GK1.5), PE-Cyanine5	ThermoFisher Scientific	15-0041-81
CMH de classe II (I-A/I-E) Anticorps monoclonaux (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700	ThermoFisher Scientific	56-5321-82
Anticorps monoclonaux CD11c (N418), PE-Cyanine5	ThermoFisher Scientific	15-0114-82
Anticorps monoclonaux F4/80 (BM8), eFluor 450	ThermoFisher Scientific	48-4801-80
CD11b Anticorps monoclonal (M1/70), APC	ThermoFisher Scientific	17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) Anticorps monoclonal (RB6-8C5), PE	ThermoFisher Scientific	12-5931-82
CD274 (-L1, B7-H1) Anticorps monoclonal (MIH5), PE-Cyanine7	ThermoFisher Scientific	25-5982-80
Anticorps monoclonal CD273 (B7-DC) (122), PerCP-eFluor 710,	ThermoFisher Scientific	46-9972-82
Anticorps monoclonal Ki-67 (B56), BV711	BD Biosciences	563755