Onderdrukking van Pro-fibrotische signalering Potentiates Factor-gemedieerde herprogrammering van muis embryonale fibroblasten in geïnduceerde Cardiomyocytes
Summary
Hier presenteren we een robuuste methode om te herprogrammeren primaire embryonale fibroblasten in functionele cardiomyocytes via overexpressie van GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 en miR-133 (GHMT2m) naast remming van TGF-β signalering. Ons protocol genereert kloppend cardiomyocytes zo spoedig 7 dagen na transductie met korting tot 60% efficiëntie.
Abstract
Trans-differentiatie van een somatische in een ander celtype heeft een enorm potentieel aan model en behandelen van ziekten bij de mens. Eerdere studies hebben aangetoond dat muis embryonale, dermale en cardiale fibroblasten kunnen worden geherprogrammeerd in functionele geïnduceerde-cardiomyocyte-achtige cellen (iCMs) via overexpressie van cardiogeen transcriptiefactoren, met inbegrip van GATA4, Hand2, Mef2c, en Tbx5 zowel in vitro als in vivo. Deze eerdere studies hebben echter aangetoond dat relatief lage efficiëntie. Om te herstellen na letsel hartfunctie, moeten mechanismen bestuur cardiale herprogrammering worden opgehelderd om efficiëntie en rijping van iCMs te verhogen.
Wij eerder aangetoond dat remming van pro-fibrotische signalering drastisch verhoogt de efficiëntie van de herprogrammering. Hier, detail we methoden een herprogrammering efficiëntie tot 60% te bereiken. Daarnaast beschrijven we verschillende methoden inclusief stroom cytometry, immunefluorescentie imaging en calcium imaging te kwantificeren herprogrammering efficiëntie en rijping van geherprogrammeerde fibroblasten. Met behulp van het protocol dat gedetailleerde hier, kunnen mechanistisch onderzoek plaatsvinden om te bepalen van de regelgevers van de positieve en negatieve cardiale te herprogrammeren. Deze studies kunnen identificeren signaalroutes die kunnen worden gericht om herprogrammering efficiëntie en rijping, die tot nieuwe celtherapieën leiden kan voor de behandeling van de ziekte van het hart van de mens te bevorderen.
Introduction
Ischemische hartziekten is een belangrijke doodsoorzaak in de Verenigde Staten1. Ongeveer 800.000 Amerikanen ervaring een eerste of terugkerende myocardiaal infarct (MI) per jaar1. Na MI, de dood van cardiomyocytes (CMs) en cardiale fibrose, gestort door geactiveerde cardiale fibroblasten, afbreuk doen aan hart functie2,3. Progressie van hartfalen na MI is grotendeels onomkeerbaar te wijten aan de slechte regeneratief vermogen van volwassen CMs4,5. Terwijl de huidige klinische therapieën vertragen van de progressie van de ziekte en verminderen risico van toekomstige cardiale gebeurtenissen6,,7,,8,9, keren geen therapieën progressie van de ziekte als gevolg van het onvermogen om te regenereren CMs na infarct10. Nieuwe celtherapieën ontstaan voor de behandeling van patiënten na MI. teleurstellend, klinische proeven leveren van stamcellen naar het hart na MI tot nu toe hebben aangetoond onduidelijk regeneratief mogelijke11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
De generatie van mens-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) van fibroblasten door overexpressie van vier transcriptiefactoren, eerst gedemonstreerd door Takahashi & Yamanaka, opende de deur naar nieuwe doorbraken in cel therapie19. Deze cellen kunnen onderscheiden in alle drie kiem lagen19, en verscheidene zeer efficiënte methoden voor het opwekken van grote aantallen CMs is eerder gebleken dat20,21. HiPSC-afgeleide CMs (heupen-CMs) biedt een krachtig platform om te bestuderen van de cardiomyogenesis en kan belangrijke gevolgen hebben voor het hart na letsel herstellen. Echter, heupen-CMs momenteel hindernissen translationeel als gevolg van de bezorgdheid van Teratoom vorming22, en hun onvolwassen aard kan pro-arrhythmogenic23. Herprogrammering van de fibroblasten in hiPSCs leidde tot interesse in direct herprogrammering fibroblasten in andere celtypes. Ieda et al. aangetoond dat overexpressie van GATA4, Mef2c en Tbx5 (GMT) fibroblasten resulteert in directe herprogrammering aan cardiale afkomst, zij het op een lage efficiëntie24. Herprogrammering van efficiëntie is verbeterd met de toevoeging van Hand2 (GHMT)25. Sinds deze vroege studies, hebben veel publicaties aangetoond dat het veranderen van de herprogrammering factor cocktail met extra transcriptie26,27,28,29 factoren, chromatine modifiers30,31, microRNAs32,33, of kleine moleculen34 tot verbeterde leidt herprogrammering efficiëntie en/of rijping van geïnduceerde cardiomyocyte-achtige cellen (iCMs ).
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het genereren van iCMs van muis embryonale fibroblasten (MEFs) met een hoog rendement. Wij eerder toonde aan dat de GHMT cocktail is aanzienlijk verbeterd met de toevoeging van miR-1 en miR-133 (GHMT2m) en is verder verbeterd wanneer pro-fibrotische signaling pathways inclusief transformeren groeifactor β (TGF-β) signalering of Rho-geassocieerde proteïne kinase (ROCK) signaalroutes zijn geremde35. Met behulp van dit protocol, we laten zien dat ongeveer 60% van de cellen express cardiale troponine T (cTnT), ongeveer 50% express α-actinin en een groot aantal cellen van de afstraffing waarneembaar zo spoedig dag 11 na transductie van herprogrammering factoren en behandeling de TGF-β typ ik receptor remmer A-83-01. Bovendien, deze iCMs express gap junction eiwitten met inbegrip van connexin 43 en spontane contractie en calcium transiënten tentoon te stellen. Dit gemarkeerd verbetering in efficiëntie ten opzichte van eerdere studies herprogrammering toont het potentieel om te regenereren CMs van endogene cel populaties die in het na hartinfarct blijven.
Protocol
Representative Results
Discussion
De huidige studie schetst een hoogrenderende strategie om rechtstreeks het herprogrammeren van fibroblasten in functionele iCMs via de levering van GHMT2m factoren gecombineerd met onderdrukking van pro-fibrotische signaalroutes herprogrammering. Met behulp van stroom cytometry, immunefluorescentie beeldvorming, calcium imaging, en het verslaan van de graven van de cel, tonen we de meerderheid van de cellen in dit protocol ondergaan succesvolle herprogrammering en aannemen van CM lineage lot. Wij hebben eerder aangetoond…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door fondsen uit van de Stichting van de Boettcher Webb-Waring biomedische Research Program, American Heart Association wetenschapper ontwikkeling Grant (13SDG17400031), Universiteit van Colorado Vakgroep Geneeskunde uitstaande vroege carrière Geleerde Program, Universiteit van Colorado divisie van cardiologie Barlow Nyle endowment en NIH R01HL133230 (naar KS). A.S.R werd gesteund door de NIH/NCATS Colorado CTSA Grant nummer TL1TR001081 en een-gepromoveerde beurs van de Universiteit van Colorado-Consortium voor fibrose onderzoek & vertaling (CFReT). Dit onderzoek werd ook ondersteund door de kanker Center ondersteuning Grant (P30CA046934), de huid ziekten Cores onderzoeksbeurs (P30AR057212) en de Stroom Cytometry kern op de Universiteit van Colorado Anschutz medische Campus.
Materials
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems – Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling – promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs – use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs – use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
- Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
- Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
- The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
- Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
- Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
- Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
- Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial – a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
- Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
- Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
- Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).
