Подавление Pro фиброзный сигнализации потенцирует фактор опосредованной перепрограммирования мыши эмбриональных фибробластов в индуцированной кардиомиоцитов
Summary
Здесь мы представляем надежный метод для перепрограммирования первичной эмбриональных фибробластов в функциональной кардиомиоцитов путем Сверхэкспрессия GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, мир-1 и мир-133 (GHMT2m) наряду с ингибированием TGF-β сигнализации. Наш протокол создает избиение cardiomyocytes как 7 дней после трансдукция с до 60% эффективности.
Abstract
Транс дифференциация одной соматической клетки типа в другой имеет огромный потенциал для моделирования и лечения заболеваний человека. Предыдущие исследования показали что мыши эмбриональные, фибробласты дермы и сердца могут быть перепрограммированы в функциональных индуцированной cardiomyocyte как клетки (ОГВС) через гиперэкспрессия кардиогенным транскрипционных факторов, в том числе GATA4, Hand2, Mef2c, и Tbx5 в пробирке и в естественных условиях. Однако эти предыдущие исследования показали относительно низкая эффективность. Чтобы восстановить функции сердца, после травмы, механизмы, регулирующие сердца перепрограммирования должны раскрыты для повышения эффективности и созревания ОГВС.
Ранее мы показали, что ингибирование pro фиброзный сигнализации резко повышает эффективность перепрограммирования. Здесь мы подробно методы для перепрограммирования эффективности до 60%. Кроме того мы опишем несколько методов, включая проточной цитометрии, immunofluorescent изображений и изображений кальция для количественного определения перепрограммирования эффективность и созревания перепрограммировать фибробластов. С использованием протокола подробно здесь, механистических исследования могут быть приняты для определить положительные и отрицательные регуляторы сердечной перепрограммирования. Эти исследования могут идентифицировать сигнальных путей, которые могут быть направлены на содействие перепрограммирования эффективность и созревания, что может привести к Роман клеточной терапии для лечения заболеваний сердца человека.
Introduction
Ишемическая болезнь сердца является ведущей причиной смерти в Соединенных Штатах1. Приблизительно 800 000 американцев опыт первого или рецидивирующие инфаркта миокарда (MI) за1год. После ми гибели кардиомиоцитов (CMs) и сердечной фиброз, сданный активированные сердечной фибробластов, повредить сердце функция2,3. Прогрессирование сердечной недостаточности после ми в значительной степени необратимы, из-за плохой регенеративной способностью взрослых CMs4,5. Хотя текущий клинической терапии замедлить прогрессирование болезни и уменьшить риск будущих сердца события6,,78,9, не терапии вспять прогрессирование болезни из-за неспособности Восстановите CMs после инфаркта10. Роман клеточной терапии начинают лечить пациентов после смертоносного MI. неутешительно, клинические испытания, обеспечивая стволовых клеток к сердцу, до настоящего времени после ми показали неубедительными регенеративный потенциал11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
Поколение человека производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) от фибробластов, гиперэкспрессия четырех факторов транскрипции, впервые продемонстрированная Такахаси и Яманака, открыл дверь в новые прорывы в ячейке терапии19. Эти клетки могут дифференцироваться в все три зародышевых19, и несколько очень эффективных методов для генерации большого количества CMs были ранее показали20,21. HiPSC производные CMs (бедра CMs) предлагает мощную платформу для изучения cardiomyogenesis и может иметь важные последствия для восстановления сердца после травмы. Однако бедра CMs в настоящее время сталкиваются поступательные препятствиями из-за проблем формирования тератома22, и их незрелых природа может быть pro аритмогенная23. Перепрограммирование фибробластов в hiPSCs вызвал интерес в непосредственно перепрограммирования фибробластов в другие типы клеток. Арип et al. продемонстрировал что Сверхэкспрессия GATA4, Mef2c и Tbx5 (GMT) в фибробласты, приводит к прямой перепрограммирования для сердечной линии, несмотря на низкую эффективность24. Перепрограммирование эффективность была улучшена с добавлением Hand2 (GHMT)25. Поскольку эти ранние исследования многих публикаций показали, что изменяя перепрограммирования фактор коктейль с дополнительной транскрипции факторы26,27,28,29, Хроматин модификаторы30,31, микроРНК32,33или малых молекул,34 , приводит к улучшению перепрограммирования эффективности и/или созревание индуцированных cardiomyocyte подобных клеток (ОГВС ).
Здесь мы предоставляем подробный протокол для создания iCMs от мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) с высокой эффективностью. Мы ранее показал, что коктейль GHMT значительно улучшилась с добавлением мир-1 и мир-133 (GHMT2m) и дальнейшего улучшения при про фиброзный сигнальные пути, включая преобразование фактор роста β (TGF-β) сигнализации или Ро связанные протеин киназы (рок) сигнальные пути являются тормозится35. Используя этот протокол, мы показываем, что приблизительно 60% клеток выразить сердечные тропонина T (cTnT), примерно 50% Экспресс α-актинина, и большое количество биений клеток может наблюдаться 11 день после трансдукции перепрограммирования факторы и лечение в кратчайшие сроки с фонд TGF-β типа ингибитор рецепторов A-83-01. Кроме того эти iCMs Экспресс разрыв соединения белков, включая connexin 43 и спонтанного сокращения и кальция транзиентов. Это отмечено улучшение перепрограммирования эффективности по сравнению с предыдущими исследованиями демонстрирует потенциал для восстановления CMs от эндогенных клеточных популяций, которые остаются в сердца после инфаркта.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящее исследование излагается стратегия высокой эффективности непосредственно перепрограммировать фибробластов в функциональных iCMs через доставку GHMT2m перепрограммирования факторы, в сочетании с подавления про фиброзный сигнальных путей. С помощью проточной цитометрии, immunofluore…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано средств от Боттчер Уэбб-Уоринг биомедицинских исследований программы Фонда, американский ученый сердца ассоциации грант развития (13SDG17400031), Университет Колорадо Департамента медицины выдающиеся начало карьеры Программа, Университет Колорадо Отдела кардиологии Барлоу Nyle Дотационный и низ R01HL133230 (для K.S). A.S.R было поддержано TL1TR001081 номер гранта NIH/NCATS Колорадо CTSA и предварительного докторских стипендий из университета Колорадо консорциума для исследования фиброз и перевода (CFReT). Это исследование было также поддерживается рака центр поддержки Грант (P30CA046934), кожи болезни исследования ядер Грант (P30AR057212) и потока Cytometry основных медицинских кампуса университета Колорадо Anschutz.
Materials
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems – Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling – promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs – use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs – use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
- Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
- Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
- The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
- Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
- Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
- Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
- Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial – a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
- Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
- Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
- Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).
