Простой и воспроизводимый метод подготовить образцы мембраны из микрососудов мозга свежевыделенных крыса
Summary
Здесь описан метод для изоляции микрососудов мозга крыс и для подготовки проб мембраны. Этот протокол имеет явное преимущество производства обогащенного microvessel образцы с приемлемым белка выход из отдельных животных. Образцы могут затем использоваться для анализа надежных белка на мозг микрососудистой эндотелия.
Abstract
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является динамической барьер ткани, которая реагирует на различные раздражители, патофизиологические и фармакологические. Такие изменения, вытекающие из этих стимулов может значительно модулировать доставки лекарств в мозг и выдвижением, вызывают значительные трудности в лечении центральной нервной системы (ЦНС) заболеваний. Многие BBB изменения, которые влияют на фармакотерапии, включать белки, которые локализованы и выражены на уровне эндотелиальных клеток. Действительно такие знания о физиологии BBB в здоровье и болезни вызвал значительный интерес к изучению этих мембранных белков. С точки зрения исследований фундаментальной науки это подразумевает потребность в простой, но надежный и воспроизводимый метод для изоляции микрососудов из ткани мозга, добываемых из подопытных животных. Чтобы подготовить образцы мембраны из свежевыделенных микрососудов, важно, что препаратов примере быть обогащенный в эндотелиальных клетках, но ограничены в присутствии других типов клеток, нервно-сосудистого подразделения (т.е., астроциты, микроглии, нейронов, pericytes). Дополнительным преимуществом является возможность готовить образцы из отдельных животных с целью захвата истинной изменчивость белков в экспериментальной населения. В этой рукописи предоставляются подробности относительно метода, который используется для изоляции микрососудов мозга крыс и подготовки образцов мембраны. Microvessel обогащения, от образцов, полученных, достигается с помощью четырех шагов центрифугирования, где декстрана включен в буфере выборки. Этот протокол может быть легко адаптирована в других лабораториях для их собственных конкретных приложений. Было показано, что образцы, созданные из этого протокола дают надежные экспериментальные данные от белка анализа экспериментов, которые могут значительно облегчить понимание BBB ответы на физиологические, патофизиологические и фармакологические стимулы.
Introduction
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) существует на стыке центральной нервной системы (ЦНС) и кровообращения и играет важную роль в поддержании гомеостаза головного мозга. В частности BBB функций для точного управления вещества концентрации в внеклеточной жидкости мозга и чтобы эффективно поставки этих питательных веществ, которые необходимы ткани мозга выполнять значительные метаболические требования ЦНС1. Эти роли подразумевают, что BBB, который существует в первую очередь на уровне микрососудистой эндотелиальных клеток, должны обладать дискретных механизмов, которые позволяют некоторые вещества, чтобы получить доступ к паренхимы мозга, обеспечивая, что может потенциально опасные ксенобиотики накапливаются. Действительно микрососудистой эндотелиальные клетки мозга не перфорированную и выставку ограниченное Пиноцитоз, которая обеспечивает отсутствие неизбирательной проницаемости2. Кроме того эндотелиальные клетки мозга microvessel Экспресс туго junction и adherens перекрестка белки, которые действуют в форме физического «печать» между соседними эндотелиальных клеток и значительно ограничивают параклеточный диффузии веществ кровь в мозг паренхимы. Действительно селективный проницаемость эндогенных и экзогенных веществ требует функциональных выражение поглощения и измеряем транспортеры3. В целом, туго развязок, adherens развязок и транспортеры работают в концерте для поддержания уникальных барьерные свойства BBB.
BBB является динамической барьер, который реагирует на физиологические, патофизиологические и фармакологические раздражителей. Например было показано модулировать выражение критических туго Джанкшен белков (т.е., occludin, ресничный occluden-1 (ZO-1)), который связан с повышенной параклеточный проницаемости сосудистой маркеров таких гипоксии/реоксигенацию стресс как сахароза4,5,6. Аналогичные замечания были сделаны на уровне BBB в параметре черепно-мозговой травмы7 и периферические воспалительные боли8,9. Эти же заболевания также могут модулировать транспортных механизмов BBB10,11,12,,1314. Действительно, гипоксии/реоксигенацию травмы повышает функциональные выражения органических анионов, транспортировки 1a4 полипептид (Oatp1a4) на BBB, которые могут привести к значительным увеличением крови к мозгу перевозки конкретных Oatp транспорта субстратов такие как 13taurocholate и аторвастатина. BBB свойства также могут быть изменены по фармакотерапии, механизм, который может стать основой для обоих глубокие изменения в эффективности препарата в головном мозге и наркотиков лекарственных взаимодействий. Например ацетаминофен цели ядерных рецепторов сигнальных механизмов в микрососудистой эндотелиальных клеток головного мозга, увеличивает функциональные выражения критических измеряем транспортера Р-гликопротеина (P-gp) и изменяет время зависимых анальгезии предоставленных морфина, опиоидов болеутоляющие наркотиков и установленным P-gp транспорт субстрат15. Глубокое понимание BBB изменений, которые могут быть индуцированных заболеваний или наркотиков, также требует определения и характеристик конкретных механизмов регулирования, которые контролируют эти изменения. Действительно, было выявлено дискретных сигналов пути в мозг микрососудистой эндотелиальных клеток, которые контролируют молекулярных выражение туго съезда белки16,17 и транспортеры15, 18,19. Взятые вместе, эти наблюдения показывают, что сложные молекулярные пути участвуют в регуляции BBB плотные соединения и транспортеров в здоровье и болезни.
Значительные трудности в изучении BBB является абсолютным требованием простой и эффективный метод для изоляции микрососудов из ткани мозга, полученных экспериментальных животных и последующей подготовки образцов мембраны. Эти образцы должны быть готовы, так что они являются обогащенный микрососудистой эндотелиальных клеток мозга и ограничены в присутствии других типов клеток. За последние несколько лет в научной литературе13,20,,2122были зарегистрированы несколько методик для изоляции microvasculature от грызунов мозга. Эта статья описывает простой, надежный и воспроизводимый метод для изоляции микрососудов от мозга крысы и для подготовки эндотелиальной мембраны обогащенный образцов, которые могут использоваться для анализа выражения протеина. Преимуществом этого протокола изоляции microvessel является возможность получения образца препаратов высокого качества и с достаточно белка урожая от отдельных экспериментальных животных. Это дает возможность рассмотрения изменчивости между животных в выражении протеина. Такое продвижение в этом протоколе значительно улучшилась надежности ВВВ исследований потому, что теперь можно избежать чрезмерной оценки (или недооценки) истинного масштаба изменений белка на BBB. Кроме того включение нескольких шагов центрифугирования с декстрана позволяет улучшенная обогащения микрососудов в экспериментальных образцов при облегчении удаления нежелательных клеточных компонентов таких нейронов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье описан простой и эффективный метод подготовки образцы протеина мембраны из микрососудов, свежезаваренным изолированы от ткани мозга крысы. Несколько подходов для изоляции микрососудов мозга крыс и/или поколение мембранных препаратов от изолированных microvasculature поступил?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантов от национальных институтов здравоохранения (R01-NS084941) и биомедицинских исследований Комиссии Аризона (ADHS16-162406) PTR. WA получил прошлом поддержки от предварительного докторских назначение национальных институтов здравоохранения обучения Грант (T32-HL007249).
Materials
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
- Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
- Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
- McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
- Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
- Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
- Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
- Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
- Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
- Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
- Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
- Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
- McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
- Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
- Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
- Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery?. AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).
