Computational analys av den Caenorhabditis elegans könsceller att studera fördelningen av atomkärnor, proteiner och cytoskelettet

Summary

Vi presenterar en automatiserad metod för tredimensionell rekonstruktion av den Caenorhabditis elegans könsceller. Vår metod bestämmer antal och placering av varje kärnan inom könsceller och analyser könsceller protein distribution och cytoskeletal struktur.

Abstract

Den Caenorhabditis elegans (C. elegans) könsceller används för att studera flera biologiskt viktiga processer inklusive stamceller utveckling, apoptos och kromosom dynamics. Medan könsceller är en utmärkt modell, är analysen ofta två dimensioner på grund av tid och arbetskraft krävs för tredimensionell analys. Stora värden i sådana studier är nummer/position av kärnor och protein fördelningen inom könsceller. Här presenterar vi en metod för att utföra automatiserad analys av de könsceller med konfokalmikroskopi och beräkningsvetenskapliga metoder för att fastställa antal och placering av atomkärnor i varje region av könsceller. Vår metod analyserar också könsceller protein distribution som gör tredimensionella undersökning av proteinuttryck i olika genetiska bakgrunder. Vår studie visar vidare, variationer i cytoskeletal arkitektur i olika regioner av de könsceller som kan rymma rumsliga utvecklingsmässiga behov. Slutligen, vår metod möjliggör automatiserad inventering av spermier i spermatheca av varje könsceller. Sammantaget möjliggör vår metod snabba och reproducerbara fenotypiska analys av den C. elegans könsceller.

Introduction

Bevarande av signalering vägar med däggdjur gör C. elegans en utmärkt modell att studera flera biologiska processer^1,2. I vårt labb använder vi den C. elegans könsceller att studera stamceller utveckling, apoptos och genuttryck. Medan könsceller är en tredimensionell struktur, är många studier två dimensionell på grund av hur tidskrävande och arbetsintensiva tredimensionell analys. Det är mycket troligt att tvådimensionell analys kan förvränga i vivo händelser i könsceller. I C. elegans vuxen hermafrodit har två könsceller armar, som inrymmer en somatisk distala spets cell (DTC) som upprätthåller distala könsceller i en odifferentierad staten^3,4. Dessa könsceller börjar skilja när de flyttar bort från DTC, flyr sitt inflytande, och bli äggceller och spermier som de når proximala ände av könsceller. Under denna process genomgå bakteriecellen atomkärnor Mitos, innan de övergår till meios^5,6. Spermieproduktionen kompletteras av larvstadium 4 (L4) av utvecklingen, varefter oocyter produceras under vuxenlivet. Sperman lagras i den spermatheca där de gödslar oocyter att generera embryon.

Det finns flera genetiska och miljömässiga faktorer som kan påverka könsceller utveckling i C. elegans som resulterar i förändringar i antalet kärnor, antal apoptotiska händelser, kromosom dynamik, och proteinuttryck eller lokalisering^{7 ,8,9,10,11}. Analysen av dessa evenemang kräver identifiering av varje etapp av differentiering baserad på kärnkraft morfologi och distribution. För att korrekt analysera dessa parametrar manuellt med en stor urvalsstorlek är arbetskrävande och tidsödande. För att kringgå dessa nackdelar och aktivera konsekvens av analys, vi utvecklat en automatiserad metod för tredimensionella undersökning av den C. elegans könsceller för kärnor räkna, kärnor distribution, proteinuttryck, och cytoskeletal struktur. Genom att kombinera konfokalmikroskopi med tredimensionell rendering, genererade vi storlek och form parametrar för identifiering av varje etapp av bakteriecellen differentiering. Denna metod gör dessutom räkna av bakteriecellen kärnor och spermier plus poängsättning av kromosom nummer i varje äggcell.

En avgörande struktur i könsceller är cytoskelettet, som ger stabilitet till könsceller fack, aids cytoplasmiska streaming och skydd till könsceller kärnor¹². Använda computational rendering, vi utfört tredimensionell rekonstruktion av könsceller cytoskelettet och identifierade distinkta cytoskeletal funktioner inom könsceller. Här beskriver vi ett stegvisa protokoll för att illustrera hur beräkningsinriktad analys i kombination med confocal imaging möjliggör omfattande analys av de C. elegans könsceller.

Vi föreslår en snabb metod för tredimensionell analys av C. elegans könsceller (figur 1). Med hjälp av tredimensionell analys är det möjligt att studera tredimensionell distribution av könsceller atomkärnor (figur 2 och figur 3), automatiserad rösträkningen celler (figur 2), rekonstruktion av könsceller cellskelettet ( Figur 3), distribution av proteiner (figur 4) och scoring antalet spermier i spermatheca och kromosomer i oocyter (figur 5). Metoden inte bara möjliggör enkel och exakt kvantifiering av könsceller men identifierar fysiologiskt relevanta fenotyper.

Protocol

1. beredning och mask djurhållning Obs: Se Tabell av material för all produktinformation. OP50 Escherichia coli kultur: kultur OP50 bakterier i Lysogeny buljong (LB) (1% trypton, 0,5% jäst, 0,5% NaCl, pH 7,0) över natten vid 37 ° C utan antibiotika. Utsäde 400 µL av OP50 bakterier att nematoder tillväxtplattor media (NGM) (1,5 g NaCl, 8.5 g agar, 1,25 g pepton, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL av 5 mg/mL kolesterol i etanol, 1 mL 1 M MgSO<su…

Representative Results

Figur 1 visar den tid som krävs för tredimensionella könsceller analys. L4 hermafroditer inkuberas vid 20 ° C var dissekeras för att isolera germlines och färgas med DAPI, phalloidin och antikroppar mot könsceller proteiner. Germlines är avbildade med konfokalmikroskopi. Färgning och confocal microscopy kräver cirka 24 h. beräkningsinriktad analys för den komplett könsceller kräver 10-15 min att räkna antal och placering av atomkärnor, identif…

Discussion

Målet med detta protokoll är att förbättra noggrannheten och minska tiden som krävs för könsceller analys. Efter standardpreparatet av dissekerade germlines, är en tredimensionell modell av könsceller atomkärnor utarbetats av computational rendering. Samtidigt som observationen av könsceller atomkärnor fördelning i rymden, beräknar tredimensionell rendering antalet kärnor på specifika regioner i könsceller. Den kritiska faktorn i vår metod är exakt definition av storlek och form parametrar av atomkärn…

Materials

C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
OP50 Escherichia coli bacteria	Homemade
Nematode Growth Media (NGM) plates	Homemade
polyclonal rabbit anti-REC-8	SDIX	29470002
Alexa 488 conjugated antibody raised in goat	Thermofisher Scientific	A-21236
Cytoskeletal dye phalloidin	Thermofisher Scientific	A-12380
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P5899
Tetramisol	Sigma Aldrich	P5899
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506
1M HEPES buffer, pH 7.4	Sigma Aldrich	G0887
10X PBS pH 7.4	Thermofisher Scientific	AM9625
Tween-20	Sigma Aldrich	P1389
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
37% Paraformaldehyde solution	Merck Millipore	1040031000
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Fluoroshield fixing reagent	Sigma Aldrich	F6182
Ethanol	Millipore	1009832511
Methanol	Sigma Aldrich	34860
20°C & 25°CIncubator	Any brand
Light microscope	Any brand
Confocal microscope	Any brand (Leica, Zeiss)
Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software.	Bitplane
Phospho buffered saline, pH 7.4	Homemade
Teflon microscope slides	Tekdon	941-322-8288