ביצוע הנוצרות על-ידי ההטיה של חלקיקים דמויי וירוס PEGylated פלורסנט מאת כימיה Dibromomaleimide-דיסולפידי
Summary
כאן, אנו מציגים את הליך כדי fluorescently functionalize את disulfides על האח מים Qβ עם dibromomaleimide. אנו מתארים Qβ ביטוי טיהור, הסינתזה של מולקולות dibromomaleimide-functionalized, ואת התגובה ההטיה בין dibromomaleimide לבין Qβ. וכתוצאה מכך צהוב הניאון מצומדת החלקיק יכול לשמש מכשיר בדיקה קרינה פלואורסצנטית בתוך תאים.
Abstract
העלייה האחרונה חלקיקים דמויי וירוס (האח מים) בביו, מחקר בנושא החומרים ניתן לייחס שלהם קלות ביוסינטזה, דיסקרטית, תיכנות גנטי בגודל biodegradability. בזמן שהם לבצע bioconjugation תגובות עבור הוספת ליגנדים סינתטי אל פני השטח שלהם, הטווח ב bioconjugation מתודולוגיות על אלה capsids נולד מימית מצומצמת יחסית. כדי להקל על הכיוון של biomaterials פונקציונלי מחקר, יש לקחת בחשבון תגובות bioconjugation לא מסורתיות. התגובה שמתואר פרוטוקול זה משתמש dibromomaleimides כדי להציג את הפונקציונליות החדשה של הממס דיסולפידי חשוף חוב של מישהו מיוחד המבוסס על Bacteriophage Qβ. יתר על כן, המוצר הסופי הוא פלורסנט, אשר יש ערך מוסף של יצירת החללית מאתריהם במבחנה באמצעות ערכת מסנן זמינים מסחרית.
Introduction
שימוש בגודל ננו capsids ויראלי התפתחה שדה מרגש, שמטרתה להרחיב את טווח יישומי מחקר ביו1,2,3. חלקיקים דמויי וירוס ביטוי recombinantly (האח מים) נגזרות מבנית וירוסים, אך הם חסרים את החומר הגנטי הנגיפי המקורי שהופך אותם חלקיקים proteinaceous שאינן זיהומיות. תכונות פני השטח הם programed גנטית, כל capsid מתבטא באופן זהה לאלה לפני ואחרי זה, זה אפשרי לדעת את המיקום ואת מספר שרשראות צד תגובתי חומצות אמינו בדייקנות קואורדינטות. במקרים רבים, הן פנים וחוץ המשטחים בעלי סוגים רבים של שאריות ממס חומצת אמינו חשוף, אשר יתכן כבניין יכול להיות functionalized דרך bioconjugation תגובות – תגובות היוצרים קשרים הדדיים בין של biomolecule סינתטיים מולקולה4,5.
תגובות Bioconjugation לעזור מולקולות של עניין יש פונקציות יותר מגוונת בצורה פשוטה יחסית. מולקולות של עניין, כגון תרופות טיפוליות6, תגיות פלורסנט7 ופולימרים8,9 יכול להיות טרום מסונתז והוא מאופיין לפני הן מצורפות על-פני האח מים. . אח נפוץ במיוחד בביו biomaterials המחקר היה האיש החשוב בהתבסס על Bacteriophage Qβ, אשר, כפי recombinantly ביטוי, הוא capsid ויראלי icosahedral 28 nm10. האתרים התגובה הנפוצה ביותר על Qβ הם lysines על ידי מרווח רחב, אבל לנו יש לאחרונה תקשרו את ההטיה מוצלחת11 של תרכובות dibromomaleimide disulfides מופחת המרפדים את הנקבוביות של Qβ באמצעות תגובה Haddleton-בייקר. התגובה ממשיך עם טוב תשואות, לא פחות חשוב, בלי לאבד את יציבות תרמית של החלקיקים. במקביל, התגובה הזו יוצרת ההטיה-induced פלורסצנטיות, בו ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר את ספיגת חלקיקי האלה לתוך התאים. בעבודה זאת, נדגים את ההטיה של פוליאתילן גליקול (PEG) על פני Qβ דרך התגובה Haddleton-בייקר, כשהתוצאה fluorophore צהוב בהיר. לאחר מכן ניתנים למעקב חלקיקים אלה כאשר הם נלקחים ידי תאים. פרוטוקול בזאת יסייע החוקרים ליצור חדש PEGylated פלורסנט חלקיקים proteinaceous בהתבסס על Qβ, על פי עקרונותיה חלים אחד רבים אחרים האח מים המכיל disulfides חשוף הממס.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהשוואה טיהור חלבון קטן, צעד ייחודי לטיהור bacteriophage Qβ הוא צנטריפוגה הדרגתי סוכרוז. לאחר השלב כלורופורם/n-butanol החילוץ, Qβ עוד יותר מטוהרים באמצעות 5-40% סוכרוז מעברי צבע. במהלך צנטריפוגה, חלקיקים מופרדים בהתאם לגודלן. חלקיקים גדולים יותר לנסוע לאזור צפיפות גבוהה יותר, בעוד חלקיקים קטנים יותר לה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.J.G. מאשר את הקרן הלאומית למדע (DMR-1654405) ואת סרטן מניעה מחקר מכון טקסס (CPRIT) (RP170752s) לתמיכה שלהם.
Materials
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4×1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated – Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
References
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
- Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
- Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
- Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. – Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
- Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
- Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
- Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
- Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
- Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochimie. 48 (47), 11155-11157 (2009).
- Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
- . Pouring LB Agar Plates Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016)
- Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
- Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
- Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
- Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
- Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).
