Att göra konjugation-inducerad fluorescerande pegylerat virusliknande partiklar av Dibromomaleimide-disulfid kemi
Summary
Här presenterar vi ett förfarande för att fluorescently functionalize i disulfides på Qβ VLP med dibromomaleimide. Vi beskriver Qβ uttryck och rening, syntesen av dibromomaleimide-functionalized molekyler och konjugation reaktionen mellan dibromomaleimide och Qβ. Den resulterande gul fluorescerande konjugera partikeln kan användas som en fluorescens sond inuti celler.
Abstract
Den senaste uppgången i virusliknande viruslika partiklar i biomedicinsk och materialforskning kan hänföras till deras användarvänlighet biosyntes, diskreta storlek, genetisk programmering och nedbrytbarhet. Medan de är mycket mottagliga för bioconjugation reaktioner för att lägga till syntetiska ligander på deras yta, är i bioconjugation metoder på dessa aqueous född förhoppningsvis relativt begränsat. För att underlätta ledning av funktionella biomaterial forskning, måste icke-traditionella bioconjugation reaktioner beaktas. Den reaktion som beskrivs i detta protokoll använder dibromomaleimides att införa nya funktioner i lösningsmedlet exponerade disulfide obligationer av en VLP baseras på Bacteriophage Qβ. Slutprodukten är dessutom fluorescerande, som har fördelen av att generera en spårbar in vitro- sonden med hjälp av kommersiellt tillgängliga filter.
Introduction
Med hjälp av nano-storlek viral förhoppningsvis har vuxit fram som ett spännande område, som syftar till att utvidga tillämpningsområdet för tillämpningar inom biomedicinsk forskning1,2,3. Recombinantly uttryckt virusliknande viruslika partiklar härrör strukturellt från virus, men de saknar den ursprungliga viral arvsmassa som gör dem icke-infektiös proteinhaltiga nanopartiklar. Som ytstrukturen är genetiskt programmerade och varje kapsid uttrycks identiskt med de före och efter det, är det möjligt att veta platsen och antalet reaktiva sida kedjor av aminosyror med atomistisk precision. I många fall besitter både exteriör och interiör ytorna många sorters lösningsmedel exponerade aminosyra rester, som lämpligen kan vara functionalized genom bioconjugation reaktioner – reaktioner som bildar kovalenta bindningar mellan en biomolecule och en syntetisk molekyl4,5.
Bioconjugation reaktioner hjälpa biomolekyler sevärdheter har mer varierande funktioner på ett relativt enkelt sätt. Molekyler av intresse, såsom terapeutiska läkemedel6, fluorescerande Taggar7 och polymerer8,9 kan vara pre syntetiseras och kännetecknas innan de är fästa på ytan av framställda. Ett särskilt vanligt VLP i biomedicinsk och biomaterial forskning har varit den VLP som baseras på Bacteriophage Qβ, som recombinantly uttryckt, är en 28 nm ikosaedriska virus kapsid10. De vanligaste reaktion webbplatserna på Qβ är lysines med råge, men vi har nyligen kommunicerat framgångsrikt konjugation11 dibromomaleimide föreningar till de reducerade disulfides som kantar porerna i Qβ via en Haddleton-Baker reaktion. Reaktionen fortsätter med bra avkastning och, lika viktigt, utan att förlora den termiska stabiliteten av partiklarna. Samtidigt genererar denna reaktion konjugation-inducerad fluorescens, som kan användas för att spåra spridningen av dessa partiklar in i celler. I detta arbete demonstrera vi konjugationen av polyetylenglykol (PEG) på ytan av Qβ genom Haddleton-Baker reaktion, som resulterar i en ljus gul fluorophore. Dessa partiklar kan sedan spåras när de tas av celler. Protokollet häri hjälper forskare generera nya fluorescerande pegylerat proteinhaltiga nanopartiklar baseras på Qβ, även om dess principer är tillämpliga på en av de många andra framställda som innehåller lösningsmedel exponerade disulfides.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jämfört med mindre protein rening, är en unik steg i rena bacteriophage Qβ den sackaros gradient centrifugeringen. Efter steget kloroform/n-butanol utvinning renas ytterligare Qβ med 5-40% sackaros övertoningar. Under centrifugeringen avskiljs partiklar utifrån deras storlekar. Större partiklar resa till regionen högre densitet, medan mindre partiklar stannar i regionen lägre densitet. Qβ reser till den nedre tredjedelen av lutningen och förblir det medan mindre protein orenheter fångas överst i centrifugr?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.J.G. erkänner National Science foundation (DMR-1654405) och Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) för deras stöd.
Materials
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4×1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated – Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
References
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
- Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
- Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
- Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. – Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
- Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
- Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
- Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
- Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
- Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochimie. 48 (47), 11155-11157 (2009).
- Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
- . Pouring LB Agar Plates Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016)
- Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
- Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
- Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
- Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
- Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).
