Sistema de proteína verde fluorescente Split Visualizar efetores entregue de bactérias durante a infecção
Summary
Abordagens de baseados em proteína fluorescentes para monitorar efetores secretadas pelas bactérias em células hospedeiras são desafiadores. Isto é devido à incompatibilidade entre proteínas fluorescentes e o sistema de secreção do tipo III. Aqui, é utilizado um sistema GFP de superfolder de separação otimizada para visualização de efetores secretada pelas bactérias para a célula da planta hospedeira.
Abstract
Bactérias, dentre os mais importantes agentes causadores de várias doenças de planta, secretam um conjunto de proteínas efetoras em célula de planta hospedeira para subverter o sistema imunológico de planta. Durante a infecção efetores citoplasmáticos são entregues para o citosol de anfitrião através de um tipo sistema do secretion de III (T3SS). Após o parto para a célula da planta, o effector(s) alveja o compartimento específico para modular processos de célula do host para a sobrevivência e replicação do patógeno. Embora tenha havido algumas pesquisas sobre a Localização subcellular das proteínas efetoras nas células hospedeiras para entender sua função na patogenicidade usando proteínas fluorescentes, investigação da dinâmica dos efetores injetados diretamente de bactérias tem sido um desafio devido à incompatibilidade entre o T3SS e proteínas fluorescentes.
Aqui, descrevemos nosso método recente de um sistema de proteína verde fluorescente de superfolder divisão otimizado (sfGFPOPT) para visualizar a localização de efetores entregadas via o T3SS bacteriana na célula hospedeira. O sfGFP11 (11th β-vertente de sfGFP)-etiquetado effector secretada através o T3SS pode ser montado com uma organela específica alvejada sfGFP1-10OPT (1-10th β-vertente de sfGFP) líder para emissão de fluorescência no local. Este protocolo fornece um procedimento para visualizar o sinal de fluorescência sfGFP reconstituído com um proteínas efetoras de Pseudomonas syringae em uma organela especial nas instalações de Arabidopsis e Nicotiana benthamiana .
Introduction
As plantas são organismos sésseis que encontram inúmeros patógenos invasores, incluindo bactérias, fungos, vírus, insetos e nematoides em todo seu ciclo de vida. Entre as phytopathogens, os patógenos bacterianos Gram-negativos tais como Pseudomonas spp. e Ralstonia spp., infectar suas plantas hospedeiras, inserindo-se através de feridas ou aberturas naturais, como os estomas e Hidatódio1. Para colonizar com sucesso plantas hospedeiras, patógenos bacterianos evoluíram para desenvolver uma variedade de fatores de virulência2. Quando as bactérias invadem uma planta hospedeira, eles injetam uma série de proteínas de virulência — conhecido como efetores — diretamente para as células da planta para promover sua patogenicidade. Esses efetores suprimem ou modulam a imunidade inata da planta e manipulam os processos celulares do anfitrião para resultar em sobrevivência bacteriana3.
Bactérias patogênicas utilizam principalmente um T3SS entregar proteínas efetoras diretamente no hospedeiro células4. O T3SS se assemelha a uma seringa molecular com um canal de agulha, conectando a partir de uma estrutura de proteína do andaime em todo o interior e as exteriores membranas bacterianas para o local da injeção do anfitrião célula5. Esse mecanismo de secreção mediada por T3SS effector (T3E) é bem conservado em vários patógenos bacterianos Gram-negativos da planta, bem como humano. Dentre os patógenos vegetais representativos, o p. syringae pv. Tomate DC3000 hrcC mutante, que geralmente tem um T3SS defeituoso, restringiu o crescimento em plantas, provavelmente devido a incapacidade do mutante para suprimir totalmente a planta imunidade (através da injeção de proteínas efetoras)6. Após translocação nas células do hospedeiro, efetores alvo várias proteínas do hospedeiro que são importantes para o sistema de célula de host, incluindo respostas de defesa vegetal, da transcrição do gene, morte celular, Proteassoma, tráfico de vesículas e hormônio vias7 , 8 , 9 , 10. portanto, o rastreamento da localização celular de proteínas efetoras nas células hospedeiras é um destino atraente para entender suas funções com relação a modulação da imunidade da planta.
A maioria dos estudos de localização do T3Es ter empregado Agrobacterium –mediada superexpressão com uma proteína grande fluorescência do anfitrião planta9. No entanto, o método de expressão heteróloga de genes que são introduzidos em outras espécies tem demonstrado ser mis localizadas ou ocasionalmente não-funcional11,12,13. Além disso, vários estudos revelaram que efetores bacterianas sofrem alteração para o direcionamento adequado no anfitrião células14,15,16,17. Portanto, transitoriamente expressa efetores no citosol da planta as células não podem ser funcionalmente ou quantitativamente idênticas para os efetores que são entregues pelo T3SS ao patógeno infecção18. Além disso, a fusão de grandes marcas fluorescentes para proteínas efetoras pode perturbar o efetor adequada visualização e entrega18,19. Portanto, essas abordagens a ensaiar a T3E função podem não totalmente refletir a localização nativa dos efetores T3SS-secretado.
Uma proteína verde fluorescente (GFP) é composta por um 11-hélice β-barril delimitador uma vertente central que inclui um cromóforo20. Waldo et al relatou um sistema de divisão-GFP romance que consiste de um pequeno componente (GFP β vertente 11; GFP11) e um fragmento complementar (vertente β GFP 1-10; GFP1-10)21. Os fragmentos não fluorescem sozinhos mas fluorescem em cima de sua própria associação, quando ambos os fragmentos estão em estreita proximidade com o outro. Para a otimização da eficiência dobramento da proteína, robustas variantes de dobramento da GFP, i.e., sfGFP e sfGFPOPT, desenvolveram-se posteriormente para a divisão GFP sistema20,21,22. Recentemente, o único aminoácido mutado variantes de sfGFP1-10OPT– sfYFP1-10OPT e sfCFP1-10OPT– que pode reconstituir com um fragmento de sfGFP11 e mostrar fluorescência de ciano e amarelo, respectivamente, foram gerados23 . Além disso, o sfCherry, um derivado do mCherry, pode ser dividido em fragmentos sfCherry1-10 e sfCherry11 da mesma maneira como sfGFP23.
Este sistema foi adaptado para rotular e rastrear os efetores T3SS em células HeLa durante a infecção usando os efetores de Salmonella24. No entanto, ele foi anteriormente não otimizado para o sistema host de patógeno vegetal-bacteriana. Recentemente, nós aperfeiçoamos o sistema GFP divisão baseado o sfGFP1-10 melhoradoOPT para monitorar a Localização subcellular do T3Es entregado a partir de p. syringae em planta células25. Para facilitar os estudos de localização da T3Es para diferentes compartimentos subcellular nas células vegetais, um conjunto de transgénicos Arabidopsis thaliana plantas foram geradas para expressar sfGFP1-10OPT nos vários compartimentos subcellular 25. Além disso, o plasmídeo que carreg uma variedade de organela-alvo sfGFP1-10OPT para o Agrobacterium-mediada superexpressão transitória e os vetores de sfGFP11-marcados para a entrega baseada em T3SS effector também foram gerados. As sementes de várias linhas de Arabidopsis transgênicas e os plasmídeos para expressar a T3Es de interesse podem ser obtidas de fontes mencionadas na Tabela de materiais26,27.
O seguinte protocolo, descrevemos um sistema otimizado para monitorar a dinâmica de efetores entregados por bactérias nas células hospedeiras usando o sistema de sfGFP de separação. Infecção de plantas expressando sfGFP1-10OPT com transgénicos Pseudomonas carregando o plasmídeo recombinante sfGFP11 resulta em uma entrega do efetor sfGFP11-tag de Pseudomonas na célula hospedeira. Em consequência, estas proteínas são reconstituídas e translocar para o compartimento de alvo específico effector. A Pseudomonas syringae pv. tomate Tensão de CUCPB5500, no qual 18 efetores são excluídos, foi usado porque esta estirpe mostrou pouca ou nenhuma morte celular em ambos a. thaliana e s. benthamianas28. No entanto, todos os materiais e os passos descritos aqui podem ser substituídos ou modificados para adaptar o sistema de sfGFP de separação para investigação de outras questões biológicas ou otimização das condições de determinado laboratório.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui é usado para monitorar a localização exata das proteínas efetoras injetado pelo T3SS bacteriana em célula de planta hospedeira ao ser infectado. Anteriormente, o sistema GFP de separação foi usado como uma ferramenta para estudar a Localização subcellular das proteínas de mamíferos23,36, Salmonella T3E localização e entrega de Agrobacterium VirE2 através da T4SS para o planta células37</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência, TIC e planejamento futuro (NRF-2018R1A2A1A05019892) para DC e por uma concessão do centro de criação de Molecular de plantas ( PMBC) do programa próxima geração Biogreen 21 do governo de Desenvolvimento Rural (PJ013201) com o EP. Agradecemos o centro de imagem do centro nacional de instrumentação para a gestão ambiental fornecer um microscópio confocal para as filmagens.
Materials
| Arabidopsis transgenic lines | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
| NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
| PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
| MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
| PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
| ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
| GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
| PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
| Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
| NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
| PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
| MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
| PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
| ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
| GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
| PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
| ER-sfCherry1-10 | Addgene | 97403 | |
| ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
| CYTO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
| sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| Bacterial strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml) | ||
| Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml) | ||
| Media components | |||
| Plant germination media | Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve. | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | Store at 4 °C. |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| LB media | Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave. Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed. | ||
| Tryptone | BD Bioscience | 211705 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| NaCl | Duchefa Biochemie | S0520 | |
| Micro agar | Duchefa Biochemie | M1002 | |
| King's B media | 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed. | ||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 212120 | |
| Anhydrous K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
| Glycerol | Duchefa Biochemie | G1345 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Bacto Agar | BD Bioscience | 214010 | |
| Mannitol-Glutamate (MG) liquid media | Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7 | ||
| Mannitol | Duchefa Biochemie | M0803 | |
| L-glutamic acid | Duchefa Biochemie | G0707 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
| Infiltration buffer | 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use. | ||
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize. |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Prepare 100 mM stock in water. Autoclave. |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Prepare 150 mM stock in DMSO. |
| Confocal microscope equipments/materials | |||
| 710 laser scanning confocal system | Carl Zeiss | ||
| Axio observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| Propidium iodide | ThermoFisher | P1304MP | |
References
- Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).
- Buttner, D. Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells. FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 4 (2013).
- Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants. J Bacteriol. 180 (17), 4523-4531 (1998).
- Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Semin Cell Dev Biol. 20 (9), 1055-1063 (2009).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).
- Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants. Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).
- Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
- Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiol. 122 (4), 999-1001 (2000).
- Courbot, M., et al. A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase. Plant Physiol. 144 (2), 1052-1065 (2007).
- Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
- Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function. J Biol Chem. 278 (16), 14196-14202 (2003).
- Reinicke, A. T., et al. A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery. J Biol Chem. 280 (15), 14620-14627 (2005).
- Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization. Cell. 137 (2), 283-294 (2009).
- Fernandez-Alvarez, A., et al. Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis. PLoS Pathog. 8 (3), e1002563 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Rigó, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cséplô, &. #. 1. 9. 3. ;. Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52 (1), 59 (2008).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 23 (1), 102-107 (2005).
- Cabantous, S., et al. A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association. Sci Rep. 3, 2854 (2013).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nat Commun. 7, 11046 (2016).
- Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors. Nat Methods. 7 (4), 325-330 (2010).
- Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017).
- . Addgene Available from: https://www.addgene.org (2018)
- . Arabidopsis Biological Resource Center Available from: https://abrc.osu.edu (2018)
- Kvitko, B. H., et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4), e1000388 (2009).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Kovach, M. E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
- Upadhyaya, N. M., et al. A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat. Mol Plant Microbe Interact. 27 (3), 255-264 (2014).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protoc. 2006 (7), (2006).
- Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).
- Nimchuk, Z., et al. Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae. Cell. 101 (4), 353-363 (2000).
- Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
- Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells. Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).
- Tanaka, S., et al. Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).
