Calorespirometry : Une approche puissante et non invasive pour étudier le métabolisme énergétique cellulaire

Résumé

Ce protocole décrit le calorespirometry, la mesure directe et simultanée de dissipation de la chaleur et la respiration, qui fournit une approche non invasive pour évaluer le métabolisme énergétique. Cette technique est utilisée pour évaluer la contribution des voies aérobies et anaérobies à l’utilisation de l’énergie en contrôlant le flux d’énergie cellulaire totale.

Résumé

Plusieurs lignées de cellules utilisées dans la recherche biologique et biomédicale fondamentale maintiennent l’homéostasie énergétique grâce à une combinaison de la respiration aérobique et anaérobique. Toutefois, la mesure dans laquelle les deux voies contribuent au paysage de la production d’énergie cellulaire est systématiquement négligée. Les cellules transformées cultivées en saturant les niveaux de glucose souvent montrent une dépendance réduite sur la phosphorylation oxydative pour la production d’ATP, qui est compensée par une augmentation de la phosphorylation au niveau du substrat. Ce changement dans l’équilibre métabolique permet aux cellules de proliférer malgré la présence de toxines mitochondriales. En négligeant la poise altérée métabolique des cellules transformées, les résultats d’un criblage pharmaceutique peuvent être mal interprétés depuis le potentiellement mitotoxic effets peuvent ne pas être détectés modèle de lignées de cellules cultivées en présence de forte concentration de glucose concentrations. Ce protocole décrit le couplage des deux techniques puissantes, respirométrie et calorimétrie, qui permet l’évaluation quantitative et non invasive des aérobies et anaérobies contributions à la production d’ATP cellulaire. Respiration aérobie et anaérobie génère de la chaleur qui peut être surveillé par calorimétrie. Pendant ce temps, mesurer le taux de consommation d’oxygène peut évaluer l’ampleur de la respiration aérobie. Lorsque la dissipation thermique et consommation d’oxygène sont mesurés en même temps, le ratio de calorespirometric peut être déterminé. La valeur expérimentale obtenue peut alors être comparée à l’équivalent d’oxycaloric théorique et l’étendue de la respiration anaérobie peut être jugée. Ainsi, calorespirometry fournit une méthode unique pour analyser un large éventail de questions biologiques, y compris le développement de médicaments, la croissance microbienne et fondamentaux bioénergétiques normoxique et des conditions d’hypoxie.

Introduction

Dans les systèmes biologiques, le dégagement de chaleur ou enthalpie changement au cours du métabolisme est généralement contrôlé soit directement (via direct calorimétrie) ou indirectement par l’intermédiaire de la consommation de₂ O ou la production de CO₂ (via respirométrie). Malheureusement, lorsque ces techniques sont utilisées dans l’isolement, information critique est perdue, comme la contribution des voies anaérobies au métabolisme cellulaire. Calorespirometry est une technique puissante qui s’appuie sur la mesure simultanée de dissipation de la chaleur et la respiration. Calorespirometric travail de pionnier étudié le métabolism....

Protocole

1. Culture cellulaire

1. Maintenir les cellules de carcinome (HepG2) hépatocellulaire humaine au moyen de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % sérum fœtal (SVF) et autres substrats (glucose 10 mM, 2 mM de glutamine et pyruvate de 1 mM) à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire (5 % CO₂ , air de 95 %, 100 % d’humidité).
   Remarque : Utilisez la formulation DMEM ci-dessus lorsque DMEM est référencée dans les étapes ultérieures de respirométrie et calorimétrie.
2. Plaque des cellules à 1 x 10⁶ cellules par plaque de 100 mm culture et sous-culture eux tous les 7 jours, ou avant d’atteindre 90 % confluenc....

Résultats

La reproductibilité des mesures de calorespirometric repose sur une préparation adéquate et cohérente. Échantillons préparés à partir de cultures cellulaires ne devraient pas servir si les plaques sont envahis par la végétation, des numérations globulaires peuvent devenir inexactes en raison de l’agglutination. Par ailleurs, les flux de chaleur réduite en raison de la diffusion limitée de substrat dans les cellules regroupées peuvent se produire. Par conséquent, lors de l’utilisation de cellules adhérentes, il est essent.......

Discussion

L’objectif de calorespirometry est d’évaluer quantitativement les contributions des voies aérobies et anaérobies à activité métabolique et d’obtenir une vue composite de flux d’énergie cellulaire. Ceci est accompli par une mesure simultanée de la dissipation de la chaleur et le flux d’oxygène suivie d’une comparaison entre le ratio calculé de CR avec l’oxycaloric théorique équivalente. Plusieurs étapes critiques doivent être considérés pour des données fiables et reproductibles. Le maintien d’une culture de cellules stér.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellules HepG2	American Type Culture Collection	HB-8065	Cellules utilisées pour la calorespirométrie
O2k-Respirometer	Oroboros Instruments	10022-02	Respirometer
LKB 2277 Moniteur d’activité thermique (TAM)	Thermométrique AB		Thermometric a été acheté par TA Instruments
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermofisher Scientific	11360070	Solution 100x ajoutée au milieu DMEM
Sérum de veau fœtal - Premiuim Select	Atlanta Biologicals	S11550	Ajouté à 10 % dans le milieu DMEM
Trypsn-EDTA (0,25 %)	Thermofisher Scientific	25200072	Réactif de dissociation cellulaire
Oligomycine à partir de Streptomyces diastatochromogenes	Sigma Aldrich  ;	O4876	Inhibiteur mitochondrial
Cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920	Découpleur mitochondrial
Corning 100 mm Plat de culture traité TC Corning	Corporation	430167	Plat de culture tissulaire
Glucose, poudre	Thermofisher Scientific	15023021	Glucose pour milieu DMEM
Galactose, poudre	Fischer Scientific	BP656500	Galactose pour milieu DMEM
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher Scientific	25030081	Glutamine pour milieu
DMEM sans glucose	Thermofisher Scientific	11966025	Milieu de culture cellulaire