Een test van de Neurosphere voor de evaluatie van de activering van de endogene neurale stamcellen in een muismodel van minimale dwarslaesie
Summary
Hier tonen we de prestaties van een minimale ruggenmerg letsel model in een volwassen muis die de centrale kanaal niche huisvesting endogene neurale stamcellen (NSCs spaart). Laten we zien hoe de bepaling van de neurosphere kan worden gebruikt voor het kwantificeren van activering en migratie van definitieve en primitieve NSCs na verwonding.
Abstract
Neurale stamcellen (NSCs) in het volwassen zoogdieren ruggenmerg zijn een relatief mitotically zwakke bevolking van periventricular cellen die kunnen worden bestudeerd in vitro met behulp van de bepaling van de neurosphere. Deze kolonie-vormende assay is een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de reactie van NSCs op exogene factoren in een schotel; Dit kan echter ook worden gebruikt om te bestuderen van het effect van in vivo manipulaties met het juiste begrip van de sterke punten en beperkingen van de test. Een manipulatie van het klinische belang is het effect van letsel op de endogene activering van de NSC. Huidige modellen van dwarslaesie bieden een uitdaging om te studeren dit omdat de ernst van de gebruikelijke kneuzingen, compressie en transect modellen leiden tot de vernietiging van de NSC niche op de site van de schade waar de cellen van de stam woont. Hier beschrijven we een minimale schade-model dat gelokaliseerde schade aan het oppervlakkige dorsolateral oppervlak van de thoracale benedenverdieping (T7/8) van het ruggenmerg volwassen muis veroorzaakt. Dit letsel model spaart het centrale kanaal op het niveau van het letsel en vergunningen van de analyse van de NSCs die zich bevinden op het niveau van de laesie op verschillende tijdstippen na letsel. Hier, laten we zien hoe de bepaling van de neurosphere kan worden gebruikt om de activering van de twee afzonderlijke, lineally-gerelateerde, populaties van NSCs die zich in het ruggenmerg periventricular regio – primitieve en definitieve NSCs bevinden studie (pNSCs en dNSCs, respectievelijk). We laten zien hoe u kunt isoleren en cultuur van deze NSCs uit de regio van de periventricular op het niveau van het letsel en de witte stof letsel site. Onze ruggenmerg na chirurgische ontledingen Toon verhoogde aantallen van pNSC en neurospheres dNSC-afgeleid uit de periventricular regio van gewonde koorden in vergelijking met de besturingselementen, hun activering via letsel te spreken. Bovendien, naar aanleiding van schade, dNSC afkomstige neurospheres kunnen worden geïsoleerd van de site schade — aantonen van het vermogen van NSCs om te migreren van hun periventricular-niche naar plaatsen van verwonding.
Introduction
Het centrale zenuwstelsel bevat een subpopulatie van zichzelf vernieuwend, multipotente stamcellen die de capaciteit hebben om te leiden naar alle andere volwassen neurale cel typen1,2,3,4. Deze neurale stamcellen (NSCs) bevinden zich in gespecialiseerde niches in de hersenen en het ruggenmerg en kan worden geactiveerd na letsel te vermenigvuldigen, migreren en differentiëren in volwassen neurale cellen. NSCs en hun nageslacht is gebleken om te migreren naar de site van de schade in5,6van de modellen van de corticale schade. In de hersenen, NSCs gebleken voor het migreren van de laterale ventrikels op de site van schade waar ze onderscheiden in astrocyten die aan gliale litteken vorming7 bijdragen. In het ruggenmerg, echter zijn weinig studies gedaan om te vragen als deze dezelfde endogene NSCs kunnen worden aangewend ter bevordering van herstel na dwarslaesie. Inderdaad, er is momenteel een debat over de vraag of de activering van de pool van de cel van de stam in het ruggenmerg een directe fysieke schade van de niche van de periventricular voering van het centrale kanaal8 vereist of als de schade aan de spinal cord parenchym (verlaten van de stam cel niche intact) is voldoende om te activeren van endogene NSCs9.
Een aantal ruggenmerg letsel (SCI) modellen zijn gebruikt om te studeren de pathofysiologie van acute en chronische blessure. Deze modellen zijn ook gebruikt om te testen potentiële therapieën voor de behandeling van SCI via neuroprotectie, Immunomodulatie en ontwikkelende cel transplantatie/vervanging strategieën10,11,13. Huidige modellen bevatten compressie en/of kneuzingen verwondingen, die leiden grootschalige functionele tekorten evenals uitgebreide laesies en cavitations in het snoer14,15 tot. Resulterende gliale littekens kunnen verschillende spinale segmenten samen met de meerderheid van de breedte/omtrek van het ruggenmerg16beslaan. Dus, terwijl deze modellen klinisch relevante zijn, zij zich veroorloven grote uitdagingen aan het bestuderen van de reactie van endogene NSCs na verwonding. Er zijn chemische modellen van schade die kan worden aangepast als u de mildere vormen van schade die het centrale kanaal17kunt sparen. Echter dit soort schade zich richten op de demyelinisatie SCI is gekoppeld en niet klinisch relevante modellen voor de fysieke en/of mechanische schade in verband met traumatische SCI.
Om de beperkingen van de huidige modellen van de schade, hebben we een naald nummer minimale SCI model, oorspronkelijk ontwikkeld in de rat9, voor de toepassing in een volwassen muismodel aangepast. Ons model aangepast letsel kunt maken van een consistente laesie van de dorsolateral regio van het ruggenmerg muis en sparen van het centrale kanaal op het niveau van het letsel (s). Het voordeel van dit model is dat het mogelijk de studie van NSC kinetiek maakt na letsel en hun potentiële radiale migratie op de site van letsel. Het gebruik van een muismodel staat ook het gebruik van transgene muizen waarmee lineage opvolging van endogene NSCs en hun nakomelingen na letsel. De eigenschappen van NSCs kunnen verder worden beoordeeld met behulp van een aangepaste vorm van de in vitro neurosphere bepaling die in dit protocol is opgenomen.
De bepaling van de neurosphere is een in vitro kolonievormend test waarmee de isolatie van de NSCs in aanwezigheid van mitogenen. Bij klonen plating dichtheden vermenigvuldigen individuele NSCs om te leiden tot vrij zwevende sferische kolonies van cellen die bestaan uit een kleine populaties van NSCs en een overgrote meerderheid van de progenitoren18,19. In ons protocol, we laten zien van het isolement van twee verschillende, lineally-gerelateerde NSCs uit de streek van de periventricular van het ruggenmerg — onder basislijn voorwaarden en na onze minimale SCI-model. Definitieve neurale stengelgroenten uitdrukkelijke nestin van cellen (dNSCs) en de gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) en zijn gegroeid in aanwezigheid van de epidermale groeifactor (EGF), fibroblast groeifactor (FGF) en heparine (samen genoemd EFH)20. Deze dNSCs zijn zeldzaam in het ruggenmerg naïef, die aanleiding geven tot zeer weinig neurospheres in vitro. Echter, laten we zien dat dNSCs worden geactiveerd na minimale SCI, uitbreiding van het aantal neurospheres van de periventricular regio21geïsoleerd. Primitieve neurale stamcellen (pNSCs) zijn voorafgaand aan de dNSCs in de bloedlijn van neurale stamcellen. pNSCs zijn uiterst zeldzaam, express lage niveaus van de pluripotent markering Oct4, en leukemie remmende factor (LiF) responsieve22. pNSCs vormen geen neurospheres wanneer geïsoleerd van het ruggenmerg volwassen muis als gevolg van de aanwezigheid van myeline basic protein (MBP) in primaire culturen; echter pNSC neurospheres kunnen worden geïsoleerd van MBP deficiënte muizen en hun nummers zijn uitgebreide volgende schade — vergelijkbaar met dNSCs21. Tot slot laten we zien dat dNSC afkomstige neurospheres kunnen worden geïsoleerd van de site van letsel bij vroege tijden na minimale SCI. Deze bevindingen tonen aan dat onze schade model en testen de kenmerken van de activering van periventricular NSCs zoals hun vermogen om te vermenigvuldigen en migreren in reactie op schade kunnen beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tijdens de chirurgische ingreep zijn er een paar kritische stappen waar de onderzoeker moet bijzondere aandacht besteden aan het verkrijgen van optimale resultaten en minimaliseren van de variabiliteit tussen de dieren. Wees voorzichtig met het geïnhaleerde anesthesie (Isofluraan) tijdens de operatie als de verdoving is aangetoond te hebben op neuroprotectieve effecten met langdurige blootstelling27. Dienovereenkomstig, bij de studie van het regeneratieve vermogen van het ruggenmerg na letsel, in…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt gefinancierd door de Stichting Krembil (exploitatiesubsidie CMM). WX was de ontvanger van het Carlton Marguerite Smith student award. NL ontving een Graduate beurs van Ontario.
Materials
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1M- 9.01g in 100mL dH2O |
| 1M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155mM- 1.30g in 100mL dH2O |
| 155mM NaHCO3 | |||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69g in 100mL dH2O |
| 1M KCL | Sigma | P5405 | 7.46g in 100mL dH2O |
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33g in 100mL dH2O |
| 108mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59g in 100mL dH2O |
References
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
- Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
- Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
- Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
- Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
- Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports – UK. 7, (2017).
- Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neurosciences. 131 (1), 177-187 (2005).
- Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
- Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
- Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
- Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
- Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
- Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
- Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
- Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
