एक Neurosphere परख का मूल्यांकन करने के लिए अंतर्जात तंत्रिका कोशिका सक्रियकरण कम रीढ़ की हड्डी की चोट के एक माउस मॉडल में स्टेम
Summary
यहां, हम एक वयस्क माउस में एक ंयूनतम रीढ़ की हड्डी की चोट मॉडल है कि केंद्रीय नहर आला आवास अंतर्जात तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) पुर्जों के प्रदर्शन को प्रदर्शित करता है । हम बताते है कि कैसे neurosphere परख के सक्रियकरण और निश्चित और आदिम चोट के बाद एनएससी के प्रवास यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) वयस्क स्तनधारी रीढ़ की हड्डी में periventricular कोशिकाओं है कि neurosphere परख का उपयोग कर इन विट्रो में अध्ययन किया जा सकता है की एक अपेक्षाकृत mitotically quiescent जनसंख्या हैं । इस कॉलोनी बनाने परख एक शक्तिशाली उपकरण एक डिश में exogenous कारकों को एनएससी की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए है; हालांकि, यह भी vivo जोड़तोड़ में ताकत और परख की सीमाओं की उचित समझ के साथ के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है । नैदानिक ब्याज की एक हेरफेर अंतर्जात एनएससी सक्रियण पर चोट के प्रभाव है । रीढ़ की हड्डी की चोट के वर्तमान मॉडल एक चुनौती प्रदान करने के लिए आम contusion, संपीड़न की गंभीरता के रूप में इस अध्ययन, और transection मॉडल चोट के स्थल पर एनएससी आला के विनाश का कारण जहां स्टेम सेल रहते हैं । यहाँ, हम कम वक्ष स्तर की सतही dorsolateral सतह पर स्थानीयकृत क्षति का कारण बनता है एक न्यूनतम चोट मॉडल का वर्णन (T7/8) वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी की. यह चोट मॉडल चोट के स्तर पर केंद्रीय नहर बख्शती है और एनएससी के विश्लेषण परमिट है कि चोट के बाद विभिन्न समय अंक पर घाव के स्तर पर रहते हैं । यहां, हम बताते है कि कैसे neurosphere परख के लिए दो अलग, लाइन से संबंधित है, एनएससी की आबादी है कि रीढ़ की हड्डी periventricular क्षेत्र में रहते है-आदिम और निश्चित एनएससी (pNSCs और dNSCs, क्रमशः) के सक्रियकरण अध्ययन का उपयोग किया जा सकता है । हम प्रदर्शन कैसे अलग और चोट के स्तर पर periventricular क्षेत्र से इन एनएससी संस्कृति और सफेद पदार्थ चोट साइट । हमारे बाद सर्जिकल रीढ़ की हड्डी विच्छेदन pNSC और dNSC की संख्या में वृद्धि हुई है-घायल डोरियों की periventricular क्षेत्र से neurospheres व्युत्पंन दिखाने के लिए, चोट के माध्यम से अपने सक्रियण के लिए बोल रहा । इसके अलावा, चोट के बाद, dNSC-व्युत्पंन neurospheres चोट साइट से अलग किया जा सकता है-एनएससी की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए अपने periventricular आला से चोट की साइटों के लिए पलायन ।
Introduction
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र स्वयं के एक उपजनसंख्या, नए सिरे से, multipotent स्टेम कोशिकाओं है कि सभी अलग परिपक्व तंत्रिका कोशिका प्रकार1,2,3,4को जंम देने की क्षमता है शामिल हैं । इन तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में विशेष niches में रहते है और पैदा करना के लिए चोट के बाद सक्रिय किया जा सकता है, विस्थापित, और परिपक्व तंत्रिका कोशिकाओं में अंतर । एनएससी और उनकी संतान को cortical चोट मॉडल में चोट साइट के लिए पलायन दिखाया गया है5,6। मस्तिष्क में, एनएससी चोट की साइट के लिए पार्श्व निलय से स्थानांतरित करने के लिए दिखाया गया है, जहां वे astrocytes में अंतर है कि glial निशान गठन7में योगदान । रीढ़ की हड्डी में, तथापि, कुछ अध्ययनों से पूछना किया गया है कि इन एक ही अंतर्जात एनएससी रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद वसूली को बढ़ावा देने के लिए दोहन किया जा सकता है । वास्तव में, वहां वर्तमान में एक बहस के रूप में है कि रीढ़ की हड्डी में स्टेम सेल पूल के सक्रियकरण periventricular आला के एक सीधे शारीरिक क्षति केंद्रीय नहर अस्तर8 या यदि रीढ़ की हड्डी पैरेन्काइमा को नुकसान (स्टेम छोड़ने की आवश्यकता है सेल आला बरकरार) अंतर्जात एनएससी9सक्रिय करने के लिए पर्याप्त है ।
रीढ़ की हड्डी की चोट के एक नंबर (विज्ञान) मॉडल तीव्र और जीर्ण चोट के pathophysiology अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इन मॉडलों को भी संभावित चिकित्सा परीक्षण के लिए neuroprotection, चुहियों के माध्यम से विज्ञान का इलाज इस्तेमाल किया गया है, और कोशिका प्रत्यारोपण के विकास/प्रतिस्थापन रणनीतियां10,11,13। वर्तमान मॉडल संपीड़न और/या contusion चोटों, जो बड़े पैमाने पर कार्यात्मक घाटे के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गर्भनाल14,15में व्यापक घावों और cavitations के कारण शामिल हैं । परिणामी glial निशान चौड़ाई के बहुमत के साथ कई रीढ़ की हड्डी के क्षेत्रों में विस्तार कर सकते है/ इस प्रकार, जबकि इन मॉडलों नैदानिक प्रासंगिक हैं, वे चोट के बाद अंतर्जात एनएससी की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण चुनौतियों का वहन । चोट के रासायनिक मॉडल है कि चोट के मामूली रूपों है कि केंद्रीय नहर17बख्श कर सकते है के कारण अनुकूलित किया जा सकता है । हालांकि, विज्ञान के साथ जुड़े ग्रासलेल्या पर चोट ध्यान के इन प्रकार के और शारीरिक और/या यांत्रिक घाव विज्ञान के साथ जुड़े नुकसान के लिए नैदानिक रूप से प्रासंगिक मॉडल नहीं हैं ।
वर्तमान चोट मॉडलों की सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हम एक वयस्क माउस मॉडल में आवेदन के लिए, मूल रूप से चूहे9में विकसित एक सुई ट्रैक न्यूनतम विज्ञान मॉडल अनुकूलित है. हमारे अनुकूलित चोट मॉडल माउस रीढ़ की हड्डी के dorsolateral क्षेत्र के एक सुसंगत घाव बना सकते है और चोट के स्तर (ओं) पर केंद्रीय नहर स्पेयर । इस मॉडल का लाभ यह है कि यह चोट के बाद एनएससी कैनेटीक्स के अध्ययन के लिए अनुमति देता है और उनके संभावित रेडियल माइग्रेशन चोट की साइट के लिए । एक माउस मॉडल का उपयोग भी ट्रांसजेनिक चूहों के उपयोग की अनुमति है कि अंतर्जात एनएससी के वंश पर नज़र रखने और उनकी संतति चोट के बाद की इजाजत दी । एनएससी के गुणों को आगे इन विट्रो neurosphere परख कि इस प्रोटोकॉल में पेश किया है की एक संशोधित रूप का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है ।
neurosphere परख एक इन विट्रो कॉलोनी-परख है कि mitogens की उपस्थिति में एनएससी के अलगाव परमिट बनाने है । क्लोनिंग चढ़ाना घनत्व में, व्यक्तिगत एनएससी पैदा करना की कोशिकाओं है कि एनएससी की एक छोटी सी आबादी के शामिल है और progenitors18,19के एक विशाल बहुमत के मुक्त अस्थाई गोलाकार कालोनियों को जंम दे । हमारे प्रोटोकॉल में, हम रीढ़ की हड्डी के periventricular क्षेत्र से दो अलग, लाइन से संबंधित एनएससी के अलगाव का प्रदर्शन-आधारभूत शर्तों के तहत और हमारे ंयूनतम विज्ञान मॉडल का पालन । निश्चित तंत्रिका स्टेम सेल (dNSCs) एक्सप्रेस nestin और glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) और एपिडर्मल वृद्धि कारक (EGF), fibroblast वृद्धि कारक (FGF), और हेपरिन (एक साथ EFH)20की उपस्थिति में उगाया जाता है । ये dNSCs भोली स्पाइनल कॉर्ड में दुर्लभ हैं, इन विट्रो मेंबहुत कम neurospheres को जन्म देते हैं । लेकिन, हम बताते है कि dNSCs ंयूनतम विज्ञान के बाद सक्रिय कर रहे हैं, periventricular21क्षेत्र से अलग neurospheres की संख्या का विस्तार । आदिम तंत्रिका स्टेम सेल (pNSCs) तंत्रिका स्टेम कोशिका वंश में dNSCs के ऊपर हैं । pNSCs बेहद दुर्लभ हैं, pluripotency मार्कर Oct4 के कम स्तर व्यक्त करते हैं, और ल्यूकेमिया निरोधात्मक फैक्टर (लिफ) उत्तरदायी22हैं । pNSCs प्राथमिक संस्कृतियों में myelin बुनियादी प्रोटीन (MBP) की उपस्थिति के कारण वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी से अलग जब neurospheres फार्म नहीं; हालांकि, pNSC neurospheres MBP की कमी चूहों से अलग किया जा सकता है और उनकी संख्या के बाद चोट का विस्तार कर रहे है-dNSCs21के समान । अंत में, हम बताते है कि dNSC-व्युत्पंन neurospheres ंयूनतम विज्ञान के बाद जल्दी समय पर चोट की साइट से अलग किया जा सकता है । इन निष्कर्षों को प्रदर्शित करता है कि हमारे चोट मॉडल और परख periventricular एनएससी के सक्रियकरण विशेषताओं का आकलन कर सकते है जैसे उनके पैदा करना और चोट के जवाब में माइग्रेट करने की क्षमता के रूप में ।
Protocol
Representative Results
Discussion
शल्य प्रक्रिया के दौरान, वहां कुछ महत्वपूर्ण कदम जहां शोधकर्ता के लिए विशेष रूप से ध्यान देना चाहिए ताकि इष्टतम परिणाम प्राप्त करने और पशुओं के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए कर रहे हैं । देखभाल स?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम Krembil फाउंडेशन (ऑपरेटिंग ग्रांट सीएमएम) द्वारा वित्तपोषित है । WX Carlton गुलबहार स्मिथ छात्र पुरस्कार के प्राप्तकर्ता था । NL एक ओंटारियो स्नातक छात्रवृत्ति प्राप्त की ।
Materials
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1M- 9.01g in 100mL dH2O |
| 1M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155mM- 1.30g in 100mL dH2O |
| 155mM NaHCO3 | |||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69g in 100mL dH2O |
| 1M KCL | Sigma | P5405 | 7.46g in 100mL dH2O |
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33g in 100mL dH2O |
| 108mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59g in 100mL dH2O |
References
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