En Neurosphere analys att utvärdera endogena neurala stamceller Aktivering i en musmodell av Minimal ryggmärgsskada
Summary
Här visar vi prestanda för en minimal ryggmärgen skadan modell i en vuxen mus som skonar den centrala kanal nischen bostäder endogena neurala stamceller (Karolina). Vi visar hur neurosphere analysen kan användas för att kvantifiera aktivering och migration av definitiv och primitiva Karolina efter skada.
Abstract
Neurala stamceller (Karolina) i vuxna däggdjur ryggmärgen är en relativt mitotiskt quiescent befolkning periventrikulär celler som kan studeras in vitro- med neurosphere analys. Denna kolonibildande analys är ett kraftfullt verktyg att studera Karolina svar på yttre faktorer i en skål; Detta kan dock också användas för att studera effekten av in-vivo manipulationer med korrekt förståelse av styrkor och begränsningar i analysen. En manipulation av den kliniska intressen är effekten av skada på endogena NSC aktiveringen. Aktuella modeller av ryggmärgsskada ger en utmaning att studera detta eftersom svårighetsgraden av gemensamma kontusion, komprimering och transection modeller orsaka förstörelse av NSC nisch på platsen för skadan där stamcellerna finns. Här beskriver vi en minimal skada modell som orsakar lokaliserad skada på ytliga dorsolaterala ytan av lägre bröstkorg (T7/8) av vuxen mus ryggmärgen. Denna skada modell reservdelar den centrala kanalen i nivå med skada och tillåter analys av de Karolina som finns på nivån av lesionen vid olika tidpunkter efter skada. Här visar vi hur neurosphere analysen kan utnyttjas för att studera aktivering av de två distinkta, lineally-relaterade, populationerna av Karolina som är bosatta i regionen periventrikulär ryggmärgen – primitiva och slutgiltiga Karolina (pNSCs och dNSCs, respektive). Vi visar hur du isolera och kultur dessa Karolina från regionen periventrikulär skada och Vit hjärnsubstans skadan webbplats. Vår postoperativa ryggmärgen dissektioner visar ökade antalet pNSC och dNSC-derived neurospheres från regionen periventrikulär av skadade sladdar jämfört med kontroller, talar till deras aktivering via skada. Dessutom efter skada, dNSC-derived neurospheres kan isoleras från skadan webbplats — visar Karolina förmåga att migrera från sin periventrikulär nisch till platser av skada.
Introduction
Det centrala nervsystemet innehåller en subpopulation av själv förnya, multipotenta stamceller som har förmåga att ge upphov till alla olika mogen neurala cell typer1,2,3,4. Dessa neurala stamceller (Karolina) bosatta i specialiserade nischer i hjärnan och ryggmärgen och kan aktiveras efter skadan skall föröka, migrera och differentieras till mogna neurala celler. Karolina och deras avkomma har visat att migrera till skadan webbplats i kortikala skadan modeller5,6. I hjärnan, har Karolina visat att migrera från de laterala ventriklarna till platsen för skadan där de differentieras till astrocyter som bidrar till gliaceller ärr bildas7. I ryggmärgen, men har få studier gjorts för att be om dessa samma endogena Karolina kan utnyttjas för att främja återhämtningen efter ryggmärgsskada. Faktiskt finns det för närvarande en debatt om huruvida aktivering av stamceller poolen i ryggmärgen kräver en direkt fysisk skada av periventrikulär nisch foder den centrala kanal8 eller om skadan till spinal cord parenkymet (lämnar stammen cell nisch intakt) är tillräcklig för att aktivera endogena Karolina9.
Ett antal ryggmärgen skadan (SCI) modeller har använts för att studera patofysiologin av akuta och kroniska skador. Dessa modeller har också använts för att testa potentiella terapier för att behandla SCI genom neuroprotektion, immunmodulering och utveckla cell transplantation/ersättning strategier10,11,13. Nuvarande modeller inkluderar komprimering eller kontusion skador, som orsakar storskaliga funktionella underskott och omfattande lesioner samt kavitation i sladd14,15. Resulterande gliaceller ärr kan spänna över flera spinal segment tillsammans med majoriteten av bredd/omkretsen av ryggmärgen16. Således, medan dessa modeller är kliniskt relevanta, de råd betydande utmaningar för studera svaret av endogena Karolina efter skada. Det finns kemiska modeller av skada som kan anpassas för att orsaka lindrigare former av skada som kan avvara den centrala kanal17. Men dessa typer av skador fokusera på den demyelinisering som är associerad med SCI och är inte kliniskt relevanta modeller för den fysiska och/eller mekanisk skada i samband med traumatiska SCI.
För att hantera begränsningar i nuvarande skada modeller, har vi anpassat en nål spår minimal SCI modell, utvecklades ursprungligen i råtta9, för tillämpning i en vuxen musmodell. Våra anpassade skada modell kan skapa en konsekvent lesion av den dorsolaterala regionen mus ryggmärgen och skona den centrala kanalen på marknadsnivå(er) ingår skada. Fördelen med denna modell är att den tillåter studier av NSC kinetik efter skada och deras potentiella radiella migration till platsen för skadan. Användning av en musmodell tillåter även användning av transgena möss som tillåter härstamning spårning av endogena Karolina och deras avkomma efter skada. Egenskaperna för Karolina kan vidare bedömas med hjälp av en modifierad form av in vitro- neurosphere analysen som introduceras i detta protokoll.
Den neurosphere analysen är en in vitro- kolonibildande analysen som tillåter isolering av Karolina i närvaro av mitogena substanser. Vid klonal plätering tätheter föröka enskilda Karolina för att ge upphov till friflytande sfäriska kolonier av celler som består av en liten subpopulation av Karolina och en stor majoritet av föräldraparets18,19. I våra protokoll, visar vi isolering av två distinkta, lineally-relaterade Karolina från regionen periventrikulär av ryggmärgen — baslinjen villkor och efter vår minimala SCI-modell. Slutgiltig neurala stamceller celler (dNSCs) express nestin och glial fibrillary sura protein (Fredsgenomförande) och odlas i närvaro av epidermal tillväxtfaktor (EGF), fibroblast tillväxtfaktor (FGF) och heparin (tillsammans kallas EFH)20. Dessa dNSCs är sällsynta i naiva ryggmärgen, ger upphov till mycket få neurospheres in vitro. Vi visar dock att dNSCs aktiveras efter minimal SCI, expanderande numrerar av neurospheres isolerade från periventrikulär regionen21. Primitiva neurala stamceller (pNSCs) är uppströms dNSCs i neurala stamceller härstamning. pNSCs är ytterst sällsynt, express låga nivåer av pluripotency markören Oct4, och leukemi hämmande faktor (LiF) lyhörd22. pNSCs utgör inte neurospheres när isolerade från vuxen mus ryggmärgen på grund av myelin grundläggande protein (MBP) i primära kulturer; dock pNSC neurospheres kan isoleras från MBP bristfällig möss och deras antal är utökad följande skada — liknar dNSCs21. Slutligen visar vi att dNSC-derived neurospheres kan isoleras från platsen för skadan på tidigt tider efter minimal SCI. Dessa resultat visar att vår skada modell och analyser kan bedöma de aktivering som kännetecknar periventrikulär Karolina såsom deras förmåga att föröka sig och migrera svar till skada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under det kirurgiska ingreppet finns det några kritiska steg där forskaren bör ägna särskild uppmärksamhet åt för att få optimala resultat och minimera variabiliteten mellan djur. Vara måste försiktig med den inhalerade anestesi (isofluran) under operation eftersom bedövningsmedlet har visat sig ha neuroprotektiva effekter med långvarig exponering27. Följaktligen, när man studerar regenerativ kapacitet av ryggmärgen efter skada, göra en insats att utföra operationen så snabbt oc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansieras av stiftelsen Krembil (driftsbidrag CMM). WX var mottagare av utmärkelsen Carlton Marguerite Smith student. NL fick en Ontario Graduate stipendium.
Materials
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1M- 9.01g in 100mL dH2O |
| 1M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155mM- 1.30g in 100mL dH2O |
| 155mM NaHCO3 | |||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69g in 100mL dH2O |
| 1M KCL | Sigma | P5405 | 7.46g in 100mL dH2O |
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33g in 100mL dH2O |
| 108mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59g in 100mL dH2O |
References
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
- Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
- Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
- Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
- Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
- Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports – UK. 7, (2017).
- Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neurosciences. 131 (1), 177-187 (2005).
- Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
- Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
- Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
- Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
- Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
- Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
- Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
- Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
