Endojen nöral kök hücre etkinleştirme en az Medulla Spinalis Yaralanmalarında, fare modeli değerlendirmek için bir Neurosphere tahlil
Summary
Burada, biz orta kanal niş konut endojen sinir kök hücreleri (NSCs) yedek bir yetişkin fare en az omurilik yaralanma modelinde performansını göstermek. Neurosphere tahlil harekete geçirmek ve yaralanma takip kesin ve ilkel NSCs geçirilmesi ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Abstract
Sinir kök hücreleri (NSCs) Yetişkin memeli spinal kord nispeten mitotically sakin bir nüfus okudu vitro neurosphere tahlil kullanarak olabilir periventriküler hücre vardır. Bu koloni oluşturan tahlil NSCs cevaben bir tabak içinde eksojen faktörleri incelemek için güçlü bir araçtır; Ancak, bu aynı zamanda vivo içinde manipülasyonlar etkisi güçlü doğru anlayış ve tahlil sınırlamaları ile eğitim için kullanılabilir. Klinik ilgi bir manipülasyon yaralanma endojen NSC etkinleştirme üzerinde etkisi olduğunu. Medulla Spinalis Yaralanmalarında güncel modelleri ortak kontüzyonu, sıkıştırma ve transeksiyon modelleri şiddeti neden olarak kök hücre bulunduğu sitesinde yaralanma NSC niş imha bu çalışma için bir meydan okuma sağlar. Burada, Yetişkin fare omurilik alt torasik düzeyi (T7/8) Yüzeysel dorsolateral yüzeyde yerelleştirilmiş hasara neden olur en az yaralanma modeli açıklar. Bu yaralanma modeli yaralanma düzeyde merkezi kanal yedek ve yaralanma takip çeşitli zaman noktalarda lezyon düzeyinde bulunan NSCs analizine izin verir. İşte, nasıl neurosphere tahlil omurilik periventriküler bölge – ilkel ve kesin NSCs ikamet NSCs iki farklı ve lineally ilgili nüfus aktivasyonu çalışma için kullanılması gereken göstermektedir (pNSCs ve dNSCs, sırasıyla). Nasıl saptamak ve bu NSCs yaralanma ve beyaz madde yaralanma site düzeyinde periventriküler bölge kültür göstermektedir. Bizim ameliyat sonrası omurilik diseksiyonlarının artan sayıda pNSC ve dNSC elde edilen neurospheres periventriküler bölge yaralı iplerden denetimleri, onların harekete geçirmek yolu ile yaralanma konuşan göre göster. Ayrıca, yaralanma, dNSC elde edilen neurospheres yaralanma sitesinden ayrılmış olabilir — NSCs onların periventriküler niş yaralanma sitelere geçirme yeteneği gösteren.
Introduction
Merkezi sinir sistemi kendi kendini yenileyerek, multipotent kök hücrelerin tüm farklı olgun sinir hücre türleri1,2,3,4‘ e çıkmasına kapasitesine sahip bir subpopulation içerir. Bu sinir kök hücreleri (NSCs) beyin ve omurilik özel niş yer alır ve çoğalırlar, göç ve olgun sinir hücrelerine ayırt etmek için yaralanma takip etkinleştirilebilir. NSCs ve onların Döl kortikal hasar modelleri5,6yaralanma sitedeki geçirilecek gösterilmiştir. Beyinde, NSCs nerede gliyal yara oluşumu7‘ ye katkıda astrocytes içine ayırt sitesine yaralanma lateral ventrikül geçirilecek gösterilmiştir. Omurilik, ancak, bu aynı endojen NSCs Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip kurtarma tanıtmak için harnessed olabilir eğer sormak kaç çalışmalar yapılmıştır. Nitekim, şu anda bir tartışma olup doğrudan fiziksel zarar merkezi kanal8 astar periventriküler niş omurilik kök hücre havuzda aktivasyonu gerektirir veya spinal hasar (kök bırakarak parankimi kordon hücre niş olduğu gibi) endojen NSCs9etkinleştirmek yeterli olur.
Omurilik yaralanma (SCI) modeller bir dizi akut ve kronik yaralanması Patofizyoloji eğitim için kullanılmaktadır. Bu modeller de neuroprotection, immunomodulation ve gelişmekte olan hücre nakli/değiştirme stratejileri10,11,13SCI tedavisinde potansiyel tedaviler test etmek için kullanılmıştır. Geçerli modelleri büyük ölçekli fonksiyonel açıkları yanı sıra geniş lezyonlar ve kavite kordon14,15‘ te neden sıkıştırma ve/veya kontüzyonu yaralanmaları içerir. Sonuç gliyal izleri genişliği/çevresi omurilik16çoğunluğu ile birlikte birkaç spinal segmentler yayılabilir. Böylece, bu modeller klinik olmakla birlikte, endojen NSCs yaralanma aşağıdaki yanıt eğitimi için önemli sorunlar paraları. Daha hafif formların merkezi kanal17yedek yaralanma neden için uyarlanmış yaralanma kimyasal modellerdir. Ancak, bu tür yaralanma SCI ile ilişkili demiyelinizasyon odaklanmak ve travmatik bilimleri ile ilişkili fiziksel ve/veya mekanik hasar klinik modeli değildir
Geçerli yaralanma modellerin sınırlarını adrese, orijinal fare9, bir yetişkin fare modeli uygulama için gelişmiş bir iğne parça en az SCI modeli, adapte olması. Adapte yaralanma modelimiz tutarlı bir lezyon fare omurilik dorsolateral bölgesinin oluşturabilir ve merkezi canal yaralanma seviyelerine adlı yedek. Bu modelin avantajı bu NSC kinetik çalışma ruhsatı mı yaralanma ve onların potansiyel radyal geçiş yaralanma siteye aşağıdaki. Bir fare modeli kullanımı da soy izleme endojen NSCs ve yaralanma takip onların Döl izin transgenik fareler kullanımına izin verir. NSCs özelliklerini daha da bu protokol için tanıttı vitro neurosphere tahlil değiştirilmiş bir formu kullanarak tespit edilebilir.
Neurosphere tahlil NSCs yalıtım mitogens huzurunda izin veren bir vitro koloni oluşturan tahlil olduğunu. Klonal kaplama yoğunlukları bireysel NSCs NSCs küçük bir subpopulation ve ataları18,19büyük bir çoğunluğu oluşan hücre serbest yüzer küresel sömürgelerine çıkmasına çoğalırlar. Bizim iletişim kuralında, spinal kord periventriküler bölgesinden iki farklı ve lineally ilgili NSCs yalıtım göstermek — temel koşullar altında ve ardından en az SCI modelimiz. Kesin sinir kök hücreleri (dNSCs) hızlı testin ve gliyal fibrillary asidik protein (GFAP’nin) ve epidermal büyüme faktörü (EGF), fibroblast büyüme faktörü (FGF) ve heparin (birlikte olarak adlandırdığı EFH)20huzurunda yetiştirilmektedir. Bu dNSCs için çok az neurospheres vitrosebebiyet veren saf spinal kord nadirdir. Ancak, biz dNSCs en az SCI, periventriküler bölge21kimden izole neurospheres sayıda genişleyen takip etkinleştirilir gösterir. İlkel sinir kök hücreleri (pNSCs) ters yönde nöral kök hücre soy dNSCs. pNSCs pluripotency işaretçiyi Oct4 düşük düzeyde son derece nadir, hızlı ve lösemi inhibitör faktörü (LIF) duyarlı22. pNSCs ne zaman yetişkin fare spinal kord miyelin temel protein (MBP) birincil kültür varlığı nedeniyle gelen izole neurospheres oluşturmaz; Ancak, pNSC neurospheres MBP eksik fareler izole olabilir ve genişletilmiş aşağıdaki yaralanma onların sayılardır — dNSCs21benzer. Son olarak, biz dNSC elde edilen neurospheres erken kez en az bilm takip yaralanma siteden izole olabilir göstermek Bu bulgular bizim yaralanma modeli ve deneyleri periventriküler NSCs yeteneklerini çoğalırlar ve yaralanma yanıt olarak göç gibi etkinleştirme özellikleri değerlendirebilir göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cerrahi işlem sırasında nerede araştırmacı belirli en iyi sonuçları elde etmek ve hayvanlar arasında değişkenlik en aza indirmek için özen birkaç önemli adımlar vardır. Anestezi nöroprotektif etkileri uzun süre maruz27olduğu gösterildiği gibi (isoflurane) inhale anestezi ile ameliyat sırasında özen göstermelidir. Buna göre omurilik yaralanma takip yeniden üretim kapasitesini okurken kadar hızlı ve verimli karıştırıcı değişkenleri önlemek için mümkün olduğu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser (çalışma hibe CMM) Krembil Vakfı tarafından finanse edilmektedir. WX Carlton Marguerite Smith Öğrenci Ödülü alıcı oldu. NL bir Ontario lisansüstü öğrenim bursu aldım.
Materials
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1M- 9.01g in 100mL dH2O |
| 1M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155mM- 1.30g in 100mL dH2O |
| 155mM NaHCO3 | |||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69g in 100mL dH2O |
| 1M KCL | Sigma | P5405 | 7.46g in 100mL dH2O |
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33g in 100mL dH2O |
| 108mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59g in 100mL dH2O |
References
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
- Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
- Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
- Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
- Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
- Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports – UK. 7, (2017).
- Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neurosciences. 131 (1), 177-187 (2005).
- Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
- Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
- Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
- Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
- Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
- Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
- Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
- Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
