Геном широкий наблюдения ошибок транскрипции в эукариотических организмов
Summary
Этот протокол обеспечивает исследователей с новым инструментом для мониторинга верности транскрипции в несколько модельных организмов.
Abstract
Для добросовестного выражение генетической информации требуется точная транскрипция. Удивительно, однако, мало что известно о механизмах, которые управляют верности транскрипции. Чтобы заполнить этот пробел в научных знаниях, мы недавно оптимизирован круг последовательности проба для выявления ошибок транскрипции на протяжении транскриптом Saccharomyces cerevisiae, дрозофилыи Caenorhabditis Элеганс. Этот протокол обеспечит исследователей с новый мощный инструмент для сопоставления пейзаж транскрипции ошибки в эукариотических клетках, что механизмы, которые управляют верности транскрипции можно освещены в беспрецедентных деталях.
Introduction
Геном обеспечивает точные биологические план жизни. Чтобы реализовать этот план правильно, это важно для геном транскрибируется с большой точностью. Однако маловероятно быть безошибочной транскрипции. Например РНК-полимеразы уже давно известны к ошибкам в пробирке1,2, и недавно было показано, что они совершают ошибки в естественных условиях также3,5,6, особенно, когда сталкивается с ДНК повреждения7,8,9,10. Взятые вместе, эти наблюдения показывают, что транскрипция ошибки возникают непрерывно во всех живых клетках, предполагая, что они могут быть мощным источником мутировавших белков.
Этот процесс называется transcriptional мутагенеза, отличается от классической мутагенез двумя способами. Во-первых в отличие от генетических мутаций, транскрипция ошибки влияют на митотическая и пост митотическая клетки, как они не зависят от репликации ДНК. Изучение механизмов, которые влияют на верность транскрипции таким образом, даст ценную информацию о мутации нагрузки митотическая и пост митотическая клеток. Интересно, что ошибки транскрипции недавно были вовлечены в поощрении белка агрегации11,12,13 и были предположил вносить обоих канцерогенеза10 и развитие резистентности к антибиотикам бактерий14.
Во-вторых в отличие от генетических мутаций, транскрипция ошибки являются временными по своему характеру. Их временное существование является особенно сложным, потому что он делает ошибки транскрипции чрезвычайно трудно обнаружить. Например в то время как несколько лаборатории разработали ценные репортер анализов для изучения transcriptional мутагенеза, эти анализы являются только возможность измерить транскрипции ошибки в ограниченном количестве контекстов и модель организмы4,15. Чтобы преодолеть эти ограничения, многие исследователи обратились к технологии последовательности РНК (РНК seq), которая теоретически позволяет транскрипции ошибки быть записан в течение транскриптом любых видов. Однако эти исследования легко осложняется библиотека строительство артефактов, таких как обратная транскрипция ошибки, ошибки амплификации PCR и подверженных ошибкам характер последовательности сам. Например реверс transcriptases совершить примерно одна ошибка каждые ~ 20000 баз, в то время как РНК полимеразы (RNAPs), как ожидается, сделать только одну ошибку каждый 300.000 базы5,6. Потому что ошибка скорость обратной транскрипции только карлики погрешность РНК полимеразы внутри клетки, это практически невозможно отличить истинное транскрипции ошибки от артефактов, вызванных библиотека подготовку в традиционных РНК-Seq данных ( Рисунок 1a).
Для решения этой проблемы, мы разработали оптимизированной версии круг-последовательности (Cirseq, или C-seq отныне) пробирного5,16. Этот assay позволяет пользователю обнаружить ошибки транскрипции и другие редкие варианты в РНК на протяжении транскриптом5. Assay последовательности циркулярное письмо носит это имя, потому что ключевой шаг в этот assay вращается вокруг РНК рецензий. После того, как circularized РНК цели, они обратной транскрипции в подвижного круга моды, производить линейное cDNA молекул, которые содержат многочисленные копии один и тот же шаблон РНК. Если ошибка находился в одном из этих шаблонов, эта ошибка будет также присутствовать в каждый один повторить содержащийся в молекуле cDNA. В противоположность этому ошибки, представленный обратной транскрипции, амплификации PCR или последовательности обычно возникают случайно и таким образом будет присутствовать только один или два повторяется. Таким образом путем создания консенсуса последовательность для каждого cDNA молекулы и отличать случайные ошибки от ошибок, которые происходят в все повторяется, Библиотека строительство артефакты эффективно может быть отделена от истинной транскрипции ошибок (рис. 1b).
Если используется должным образом, C-seq assay может использоваться для точно определить уровень базового замен, вставок и удалений в РНК на протяжении транскриптом любых видов (см. Например, Траверс и Ochman17). Например мы использовали C-seq assay предоставлять генома общесистемной измерения коэффициента ошибок транскрипции в Saccharomyces cerevisiaeи Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans с разрешением единый базовый5 (неопубликованные наблюдения). Первоначально используется для точного последовательности РНК вируса населения, это оптимизированная версия C-seq пробирного была оптимизирована для сведения к минимуму суровых условиях во время подготовки библиотеки, которые способствуют библиотека строительство артефакты. Кроме того с помощью ряда коммерчески доступные наборы, пропускная способность assay значительно улучшилось, а также ее удобство. Если используется должным образом, этот assay может точно определить транскрипции ошибок в репликации, тем самым значительно улучшая на предыдущих исследований6тысячи. В целом этот метод является мощным инструментом для изучения transcriptional мутагенеза и позволит пользователю получить новые идеи в механизмы, контролирующие точность транскрипции в широком диапазоне организмов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем оптимизированный протокол для подготовки библиотек C-seq для обнаружения ошибок транскрипции в Saccharomyces cerevisiaeи Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans. Этот протокол имеет многочисленные преимущества по сравнению с существующими протоколами, а также альтернативные м…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это издание стало возможным благодаря финансирование от Грант T32ES019851 (C. Fritsch), R01AG054641 и следователь молодой Афар предоставить (M. Вермюльст).
Materials
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µl) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 ml Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
References
- Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
- Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
- Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
- Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
- Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
- Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
- Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
- Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
- Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
- Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
- van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer’s disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
- van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer’s and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
- Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
- Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
- Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
- Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
- Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Kent, W. J. BLAT–the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
- Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
- Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).
