מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים
Summary
פרוטוקול זה מספק חוקרים עם כלי חדש כדי לפקח על הנאמנות של שעתוק אורגניזמים דגם מרובים.
Abstract
תמלול מדויק נדרש עבור הביטוי הנאמן של מידע גנטי. באופן מפתיע למרות, מעט מאוד ידוע על המנגנונים השולטים על הנאמנות של שעתוק. כדי למלא את הפער הזה של הידע המדעי, אנחנו לאחרונה ממוטב וזמינותו מעגל-רצף כדי לזהות שגיאות תיעתוק ברחבי transcriptome של האפייה, melanogaster דרוזופילה Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה יספק לחוקרים עם כלי חדש חזק כדי למפות את הנוף של שגיאות תיעתוק התאים האיקריוטים כך מנגנוני בקרה על הנאמנות של שעתוק יכולים להיות הובהר בפירוט חסר תקדים.
Introduction
הגנום מספק שרטוט ביולוגי מדויק של החיים. כדי ליישם תוכנית זו כראוי, חשוב על הגנום יש לשעתק בדייקנות נהדרת. עם זאת, תמלול סביר להיות נטולת שגיאות. לדוגמה, ה-RNA polymerases יש כבר זמן רב ידוע להיות מועדת לטעויות במבחנה1,2, לאחרונה זה הוצג כי הם מבצעים שגיאות ויוו וכן3,5,6, במיוחד כאשר קיימות עם ה-DNA נזק7,8,9,10. יחדיו, תצפיות אלה מציינים כי שגיאות תיעתוק מתרחשים ללא הרף כל התאים החיים, רומז שאולי הם מקור עשיר של חלבונים מוטציה.
התהליך הזה, הנקרא תעתיק מוטגנזה מכוונת, שונה מוטגנזה מכוונת קלאסית בשתי דרכים. ראשית, בניגוד מוטציות גנטיות, שגיאות תיעתוק להשפיע mitotic והן שלאחר mitotic תאים, כפי שהם אינם תלויים שכפול ה-DNA. לומד את המנגנונים להשפיע על הנאמנות של שעתוק, לכן, יספק תובנות בעלות ערך לתוך עומס מוטציה של תאים mitotic והן שלאחר mitotic. . מעניין, שגיאות תיעתוק לאחרונה היו מעורבים בקידום חלבון צבירת11,12,13 , היה שיערו לתרום שני carcinogenesis10 ו התפתחות עמידות לאנטיביוטיקה חיידקים14.
שנית, בניגוד מוטציות גנטיות, שגיאות תיעתוק אינם ארעי בטבע. קיומם הזמני הוא מאתגר במיוחד כי זה עושה שגיאות תיעתוק קשה מאוד לזהות. לדוגמה, בעוד מספר מעבדות המציאו כתב ערך מבחני לחקר מוטגנזה מכוונת תעתיק, מבחני אלה מסוגלים רק למדוד שגיאות תיעתוק במספר מוגבל של ההקשרים, מודל אורגניזמים4,15. כדי להתגבר על מגבלות אלה, חוקרים רבים פנו טכנולוגיה רצפי RNA (RNA-seq), המאפשר תיאורטית שגיאות תיעתוק שיירשמו ברחבי transcriptome של כל מין. עם זאת, מחקרים אלה הם בקלות מבולבל על ידי ספריית הבנייה חפצים, כגון שגיאות תיעתוק הפוכה, PCR הגברה שגיאות הטבע לשגיאות של רצף עצמה. לדוגמה, הפוך transcriptases התחייב כ שגיאה אחת בכל הבסיסים ~ 20,000, בעוד ה-RNA polymerases (RNAPs) צפויים לעשות שגיאה אחת בלבד בכל הבסיסים 300,0005,6. כי שיעור שגיאה של שעתוק במהופך לבד גמדים שיעור שגיאה של RNA polymerases בתוך תאים, זה כמעט בלתי אפשרי להבחין שגיאות תיעתוק האמיתי לבין חפצים הנגרמת על ידי הכנת ספריה בנתוני ה-RNA-Seq המסורתית ( איור 1a).
כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו גירסה אופטימיזציה של המעגל-הרצף (Cirseq, או C-seq מעתה ואילך)5,assay16. Assay זה מאפשר למשתמש לזהות שגיאות תיעתוק והווריאנטים נדירים אחרים ב- RNA ברחבי transcriptome5. מעגלי-רצף וזמינותו שיישא את השם הזה כי צעד המפתח assay הזה סובב סביב ה-RNA circularization. פעם אחת המטרות RNA הם circularized, הם הפוכה עיבד באופן מעגל המתגלגל, לייצר מולקולות cDNA לינאריים המכילות עותקים רבים של אותה תבנית הרנ א. אם שגיאה היה נוכח באחת מתבניות אלה, שגיאה זו גם יהיה נוכח בכל חוזר יחיד בתוך המולקולה cDNA. לעומת זאת, טעויות שנעשות על ידי שעתוק במהופך, PCR הגברה או רצף נוטים להיווצר באקראי, ובכך יהיה נוכח חזרה אחד או שניים בלבד. לפיכך, על ידי יצירת רצף קונצנזוס עבור כל מולקולה cDNA, הבחנה שגיאות אקראי של שגיאות כל חזרה, ספריית הבנייה חפצים יכול ביעילות ניתן להפריד בין שגיאות תיעתוק אמיתי (איור 1b).
אם משתמשים בו כראוי, ניתן להשתמש וזמינותו C-seq במדויק לזהות קצב הבסיס החלפות, הוספות ומחיקות RNA ברחבי transcriptome של כל מין (ראה לדוגמה, טרוורס, Ochman17). לדוגמה, השתמשנו וזמינותו C-seq לספק מדידות ברמת הגנום של שיעור שגיאה של שעתוק האפייה, דרוזופילה melanogasterו Caenorhabditis elegans עם רזולוציה בסיס יחיד5 (לא פורסם תצפיות). במקור נהגו במדויק רצף אוכלוסיות וירוס רנ א, גירסה זו אופטימיזציה של C-seq וזמינותו התייעלה כדי למזער בתנאים קשים במהלך הכנת ספריה לתרום חפצים בניית ספריה. בנוסף, באמצעות מספר ערכות זמינים מסחרית, התפוקה של וזמינותו במידה רבה משופרת, כמו גם ידידותיות למשתמש שלה. אם משתמשים בו כראוי, וזמינותו הזה יכול לזהות במדויק אלפי שגיאות תיעתוק לכל שכפול, ובכך מיעיל באופן משמעותי על מחקרים קודמים6. בסך הכל, בשיטה זו מספק כלי רב עוצמה כדי ללמוד מוטגנזה מכוונת תעתיק, יאפשר למשתמש לקבל הרומן תובנות לגבי המנגנונים השולטים על הנאמנות של שעתוק במגוון רחב של אורגניזמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ממוטב עבור הכנת C-seq ספריות איתור שגיאות תיעתוק האפייה, דרוזופילה melanogasterו Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה יש יתרונות רבים על פני הפרוטוקולים הקיימים, כמו גם טכניקות חלופיות.
במהלך 15 השנים האחרונות, מערכות כתב רבים פותחו המסתמכים על לוציפרא…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרסום זה התאפשר על ידי מימון גרנט T32ES019851 (ל ג Fritsch), R01AG054641, חוקר צעיר עפר להעניק (Vermulst מ’).
Materials
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µl) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 ml Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
References
- Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
- Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
- Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
- Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
- Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
- Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
- Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
- Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
- Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
- Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
- van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer’s disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
- van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer’s and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
- Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
- Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
- Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
- Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
- Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Kent, W. J. BLAT–the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
- Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
- Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).
