Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları
Summary
Biz üç farklı doku hazırlama teknikleri immunohistokimyasal görselleştirme sıçan retina mikrovasküler perisitlerden, Yani, soğutucu bölümü, Bütün bağlar ve damar ağının hipotonik yalıtım için göstermek.
Abstract
Retina perisitlerden, göz birçok hastalıkları için önemli bir rol oynamaktadır. İmmunohistokimyasal teknikler retina damarları ve mikrovasküler boyama perisitlerden Oftamolojik araştırma merkezi. Mikrovasküler perisitlerden görüntülenmesi uygun bir yöntem seçmek çok önemlidir. Cryo-bölümlerde, Bütün bağlar ve antikorlar trombosit-türevi büyüme faktörü reseptör β (PDGFRβ) ve sinir/gliyal antijen 2 (NG2) için kullanma hipotonik izole damarlara boyama Retina mikrovasküler pericyte immunohistokimyasal açıklar. Bu avantajları ve her Retina mikrovasküler perisitlerden görselleştirme üç doku hazırlıkları eksikliklerin vurgulamak için bize izin verir. Cryo-bölümler tüm Retina katmanları transsectional görselleştirme sağlar ancak yalnızca bir kaç ara sıra enine keser microvasculature içerir. Bütün Dağı tüm Retina damarlara genel bir bakış sağlar, ancak microvasculature görselleştirme zahmetli olabilir. Hipotonik yalıtım nöronal hücre kaldırma tarafından tüm Retina damarlara görselleştirmek için bir yöntem sağlar, ancak bu doku çok kırılgan yapar.
Introduction
Bu hücreler damarlara bütünlük içinde önemli bir rol oynamak gibi Retina perisitlerden birçok araştırma laboratuvarları odaklanmıştır. Diyabetik retinopati1, iskemi2ve glokom3 gibi patolojik durumların perisitlerden fonksiyonu içeren vasküler özellikleri vardır. Perisitlerden iç retinal kapiller plexuses bulunur. Kapiller plexuses iki kat iç retina malzemeleri santral retinal arter dalları. İç vasküler yatağın ganglion hücre ve iç nükleer katmanları arasında yer almaktadır. Daha derin tabaka daha yoğun ve karmaşık ve iç ve dış nükleer katmanlar4,5arasında yerelleştirilmiştir. Buna ek olarak, retinanın bazı bölümlerinin de radyal parapapillary kılcal olarak adlandırdığı bir üçüncü ağ içerir. Bunlar uzun, düz kılcal damarlar, sinir lifleri arasında ve nadiren başka bir veya diğer iki plexuses6ile anastomose. Kapiller duvarı içinde perisitlerden membran içinde gömülü ve vasküler endotel hücrelerinin abluminal yan hat.
Bu tarihe kadar bunları diğer vasküler hücrelerden ayırt bu perisitlerden hiçbir benzersiz biyolojik işaret vardır. Trombosit-türevi büyüme faktörü reseptör β (PDGFRβ) ve sinir/gliyal antijen 2 (NG2) yaygın olarak kullanılan işaretleri olan perisitlerden ama aynı zamanda diğer damar hücreleri üzerinde mevcut vardır. Perisitlerden tanımlaması daha fazla Morfoloji ve protein ifade7‘ farklılık pericyte alt kümeleri varlığını tarafından karmaşıktır. Şu anda, en iyi kimlik protein işaretleri bir arada ve damar duvarındaki pericyte karakteristik konumlandırma yararlanır. Biz burada sıçan retina mikrovasküler perisitlerden, yani, cryo-bölümler, Bütün bağlar ve damar ağının hipotonik yalıtım PDGFRβ/NG2 immunohistokimyasal boyama için üç farklı doku hazırlama teknikleri göstermek.
Cryo-bölümleri ile retina ve sklera ile optik sinir kesilir. Bu nöronların tüm katmanlı yapılar görselleştirme için sağlar. Retina farklı on kat hematoksilen eozin veya floresan nükleer 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8gibi lekeleri ile görüntülenmiştir nükleer ve aksonal/dendritik yapıları değişiminin olarak görünür. Katmanlar9 ve bu metabolik gereksinimleri farklıdır belirli bir katmanı kalınlığı veya toplam yokluğunda belirlemek için bir yöntem sağlar (Örneğin, Retina ganglion hücrelerinin kaybı biridir retinal iskemi10, işaretlerinden 11). Ayrı ayrı çalışma içinde anılan sıraya göre Retina katmanları12,13kapiller plexuses edinerek retina ile enine keser gibi damarlara belirgindir.
Daha geleneksel olarak, Retina damarlara ağ araştırmalar Retina bütün-dağ içinde gerçekleştirilir. Bu doku hazırlık ile retina kesme ve bir çiçek şeklindeki yapı olarak basık. Genel mimari Retina damarlara vurgulayabilirsiniz nispeten hızlı doku Hazırlama tekniği yöntemidir ve bu nedenle kez fare retina neovaskülarizasyon soruşturma uygulanır. Bütün Monte Retina microvasculature başarılı görselleştirme aynı zamanda gelişmekte olan yenidoğan fare ve sıçan retina14,15,16,17,18, bildirilmektedir 19. bu çalışmalar geniş kılcal içermeyen alanlar yenidoğan retina14‘ e göre yetişkin bir daha tanımlı pericytic aktivitesiyle ortaya koyuyor.
Görselleştirmenin başka bir retina microvasculature sonra hipotonik yalıtım yoludur. Bu doku hazırlama teknik retinal kan damarları ve kılcal nöronal hücrelerin serbest bırakılması ile sonuçlanır. İki boyutlu görüntüleme izole retinal damar ağının bu tür genellikle Retina tripsin sindirim20 sonra gerçekleştirilen ve diyabetik retinopati dahil pericyte kaybı ve kılcal damar anormallikleri değerlendirmek için kullanılan dejenerasyon20,21,22. Onlar yapılmıştır gibi RT-PCR ve western Blot23,24,25ile hipotonik yalıtım yöntemini retinal vasküler gen ve protein düzenleyici yanıt araştırmalar sunuyor. Burada ücretsiz-float immunohistokimyasal hipotonik izole Retina damarlara tripsin sindirim mikrovasküler perisitlerden incelemek için bir alternatif olarak boyama için bir protokol sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz mikrovasküler Retina perisitlerden çalışmada uygulanan üç Retina hazırlama teknikleri mevcut. Aşağıda, yöntemlerinden her birinin arasında bir karşılaştırma sağlamak ve protokolleri kritik adımlar vurgulayın.
Cryo kesit ile retina sagittal bölümlerde kesilir ve bu nedenle, çok sayıda numune aynı retina elde etmek mümkün. Bu yöntemin sonucu sayısal bölümlerde antikor özgüllük ve gereksiz hayvan kurban engeller olarak titrasyon testi için ideal bir seçim ya…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Araştırma Lundbeck Vakfı, Danimarka tarafından finanse edildi.
Materials
| Geletin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolved in 0.15 M NaCl |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lot 129348 | |
| Rabbit anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
| Anti-fading mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
References
- Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. Diabetic retinopathy: Breaking the barrier. Pathophysiology. , (2017).
- Cai, W., et al. Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke. Translational Stroke Research. , (2016).
- Trost, A., et al. Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).
- Ramos, D., Lagali, N., et al. The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels. Confocal Laser Microscopy – Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).
- Moran, E. P., et al. Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).
- Henkind, P. Microcirculation of the peripapillary retina. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O’Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte?. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, 451-455 (2016).
- Fernandez-Bueno, I., et al. Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).
- Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. N. Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature. Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).
- Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
- Kyhn, M. V., et al. Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation. Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).
- Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina. Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).
- Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).
- Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents. Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).
- Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nature Communications. 8, 15296 (2017).
- Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).
- Lange, C., et al. Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice. Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).
- Higgins, R. D., et al. Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy. Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).
- Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).
- Hazra, S., et al. Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).
- Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes. Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).
- Gustavsson, C., et al. Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia. PLoS One. 5, e12699 (2010).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).
