Analyse de AtHIRD11 désordre intrinsèque et la liaison vers les Ions métalliques par électrophorèse capillaire et l’électrophorèse capillaire affinité

Markus Nachbar; Jorrit Maul; Matthias Stein; Hermann Wätzig

doi:10.3791/57749

Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Analyse de AtHIRD11 désordre intrinsèque et la liaison vers les Ions métalliques par électrophorèse capillaire et l’électrophorèse capillaire affinité

5.6K vues

⸱

DOI :

10.3791/57749

⸱

22 août 2018

Markus Nachbar¹ , Jorrit Maul¹ , Matthias Stein¹ , Hermann Wätzig¹

¹Institute of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, TU Braunschweig

Dans cet article

Résumé

Ce protocole combine la caractérisation d’un échantillon de protéines par électrophorèse capillaire et une projection de liaison rapide avec les ligands chargés par électrophorèse capillaire en affinité. Il est recommandé pour les protéines avec une structure souple, comme les protéines intrinsèquement désordonnées, afin de déterminer les différences dans la liaison des différents conformères.

Résumé

Les plantes sont fortement dépendantes de leur environnement. Pour s’adapter à des changements stressants (par exemple, la sécheresse et à une salinité élevée), les plantes supérieures évoluent classes de protéines intrinsèquement désordonnées (PDI) pour réduire le stress oxydatif et osmotique. Cet article utilise une combinaison de l’électrophorèse capillaire (CGE) et de la mobilité Maj affinité électrophorèse (ACE) pour décrire le comportement de liaison de différents conformères de l’IDP AtHIRD11 d’Arabidopsis thaliana. CGE est utilisé pour confirmer la pureté de AtHIRD11 et d’exclure les fragments, modifications post-traductionnelles et autres impuretés comme raisons de modèles complexes de pointe. Dans cette partie de l’expérience, les différents exemples de composants sont séparés par un gel visqueux à l’intérieur d’un tube capillaire par leurs différentes masses et détectés par un détecteur à barrettes de diodes. Par la suite, le comportement de liaison de l’échantillon vers différents ions métalliques est étudié par l’ACE. Dans ce cas, le ligand est ajouté à la solution tampon et le décalage dans le temps de migration est mesuré afin de déterminer si un événement de liaison a eu lieu ou non. Un des avantages de l’utilisation de la combinaison de la CGE et ACE pour déterminer le comportement de liaison d’un PCI est la possibilité d’automatiser l’électrophorèse de gel et l’essai de liaison. En outre, CGE indique une limite inférieure de détection que l’électrophorèse de gel classique et ACE est en mesure de déterminer le mode de liaison d’un ligand d’une manière rapide. En outre, ACE peut également être appliqué à d’autres espèces chargées que les ions métalliques. Cependant, l’utilisation de cette méthode pour les expériences de liaison est limitée dans sa capacité à déterminer le nombre de sites de liaison. Néanmoins, la combinaison de la CGE et ACE peut être adaptée pour caractériser le comportement de liaison de n’importe quel échantillon de protéines vers nombreux ligands chargés.

Introduction

Les plantes sont plus dépendantes de leur environnement que beaucoup d’autres formes de vie. Étant donné que les plantes ne peuvent pas se déplacer à d’autres endroits, ils doivent s’adapter à des changements dans leur environnement (p. ex., sécheresse, froides et hautes concentrations salines). Par conséquent, plantes supérieures développé des protéines de stress spécialisés comme les alignements, qui remplissent des tâches multiples afin de réduire le stress cellulaire lié à une salinité élevée. Ces protéines se lient l’eau et des ions à l’intérieur des cellules, réduire le stress oxydatif en liant Cu^{2 +}-ions et d’interagir avec les phospholipide....