تحليل AtHIRD11 اضطرابات جوهرية وملزمة تجاه أيونات المعادن بالتفريد جل الشعرية وتقارب التفريد الشعرية
Summary
يجمع هذا البروتوكول توصيف عينة البروتين بالتفريد جل الشعرية وغربلة سريعة-ملزم يغاندس مشحونة بالتفريد الشعرية تقارب. من المستحسن للبروتينات مع بنية مرنة، مثل البروتينات اضطرابه جوهريا، لتحديد أي اختلافات في ربط كونفورميرس مختلفة.
Abstract
النباتات التي تعتمد بشدة على بيئتهم. من أجل التكيف مع التغيرات المجهدة (مثلاً، والجفاف والملوحة العالية)، تتطور النباتات العليا وفئات من البروتينات اضطرابه جوهريا (المشردون داخليا) للحد من التوتر التأكسدي وناضح. هذه المقالة يستخدم مزيجاً من جل الشعرية التفريد (فريق الخبراء الاستشاري) والتنقل shift تقارب التفريد (ACE) لوصف سلوك ملزمة كونفورميرس مختلفة من AtHIRD11 المشردين داخليا من نبات التمويل. يستخدم فريق الخبراء الاستشاري لتأكيد نقاء AtHIRD11 واستبعاد الأجزاء والتعديلات بوسترانسلاشونال، وغيرها من الشوائب كأسباب لأنماط معقدة الذروة. في هذا الجزء من التجربة، مفصولة هلام لزج داخل شعري واسطة كتلها مختلفة المكونات العينة مختلفة والكشف مع جهاز كشف صفيف صمام ثنائي. بعد ذلك، يجري التحقيق في سلوك ملزمة العينة نحو الأيونات المعدنية المختلفة بايس. في هذه الحالة، يجند يضاف إلى الحل المخزن المؤقت ويتم قياس التحول في وقت الترحيل من أجل تحديد ما إذا كان حدث ربط حدث أم لا. واحدة من مزايا استخدام المزيج من فريق الخبراء الاستشاري وايس لتحديد سلوك ملزمة المشردين داخليا هو إمكانية أتمتة التفريد جل والمقايسة ملزمة. وعلاوة على ذلك، فريق الخبراء الاستشاري ويبين حد أدنى للكشف من التفريد جل الكلاسيكية وايس قادرة على أن تحدد بطريقة ملزمة يجند بطريقة سريعة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تطبيق ACE للأنواع الأخرى مشحونة من الأيونات المعدنية. بيد أن استخدام هذا الأسلوب لربط التجارب هو محدودة في قدرتها على تحديد عدد المواقع الملزمة. ومع ذلك، يمكن تكييفها مع المزيج من فريق الخبراء الاستشاري وايس لوصف سلوك ملزمة لأي عينة البروتين نحو يغاندس اتهم العديد.
Introduction
النباتات أكثر اعتماداً على بيئتها من العديد من أشكال الحياة الأخرى. إذ لا يمكن نقل النباتات إلى أماكن أخرى، لديهم للتكيف مع التغيرات في البيئة المحيطة بهم (مثلاً، الجفاف، البرد وارتفاع تركيزات الملح). ونتيجة لذلك، وضعت النباتات العليا البروتينات الإجهاد المتخصصة مثل ديهيدرينس، التي تفي بالمهام المتعددة للحد من التوتر الخلية تتصل بالملوحة العالية. هذه البروتينات ربط الماء والايونات داخل الخلايا، والحد من الأكسدة بربط Cu2 +-الأيونات، والتفاعل مع فوسفوليبيدات، فضلا عن سيتوسكيليتونس. وعلاوة على ذلك، ربط Zn2 +-الأيونات تسمح هذه البروتينات بمثابة عوامل النسخ. القدرة على ربط Ca2 +-الأيونات بعد الفسفرة كما تم الإبلاغ عن1.
سلوك متعدد الوظائف لهذه البروتينات يرتبط بعدم وجود مخلفات الأحماض الأمينية مسعور. وبالتالي فإنها تفتقر إلى أي التفاعلات مسعور داخل سلسلة الببتيد وبنية مقيدة أيضا. ومع ذلك، نظراً لأن هذه البروتينات تفتقر إلى هيكل تقييدية، التي يشغلونها كونفورميرس مختلفة تحت نفس الظروف. ولذلك، يمكن وصف أفضل كفرقة هياكل بدلاً من تكيف واحد. تعرف البروتينات بهذه الخصائص كما جوهريا اضطرابه البروتينات (داخليا) ومفهوم مستخدمة على نطاق واسع للبروتينات الإجهاد والحديث المتبادل بين مسارات مختلفة في الخلايا حقيقية النواة2.
واحد من هذه الأشخاص المشردين داخليا المتصلة بالإجهاد هو AtHIRD11. أنها واحدة من التمويل نباتشديدة الجفاف-أعرب معظم النازحين. ومن ثم، كونفورميرس مختلفة يمكن أن تكون مفصولة دائرة نصف قطرها فعالة لشحن نسبة، والتفريد الشعرية (CE) وقد استخدمت لإجراء مزيد من التحقيقات. آيس التجارب السابقة أثبتت التفاعلات بين AtHIRD11 وأيونات المعادن الانتقالية مثل Cu2 +Zn2 +-، Co2 +وني2 +-الأيونات. ويمكن الاطلاع على النتائج المفصلة في هارا et al. 3 وناخبار et al. 4.
تستند الطريقة آيس التي سيتم استخدامها هنا لدينا الأعمال المنشورة في وقت سابق6. ومع ذلك، إضافة اسيتانيليد علامة EOF إلى عينة البروتين ليست مناسبة. AtHIRD11 يعرض أنماط ذروة واسعة، وإضافة علامة EOF إلى العينة أن تخفي قمم اثنين. ولذلك، يتم استخدام العلامة في تشغيل منفصلة. قبل النظر في سلوك ملزمة، من المؤكد أن قمم عثر عليها خلال التجارب السابقة من كونفورميرس مختلفة. وهكذا، يستخدم فريق الخبراء الاستشاري للتمييز بين كونفورميرس البروتين، تعديل بوستترانسلاشونال البروتين والشوائب، مثل أجزاء من AtHIRD11، بكتلها مختلفة. وفي وقت لاحق، التحقيق في العينة AtHIRD11 يتسم سلوك ربط نحو مختلف الأيونات المعدنية المختلفة.
والغرض من هذه المقالة وصف إعداد تجريبية للتمييز بين المشردين داخليا والمكونات الأخرى من عينة من أجل تقييم الاختلافات في سلوك ملزمة كونفورميرس مختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لجميع CE التجارب، إعداد الشعرية خطوة حاسمة. أنها أنبوب زجاج يبلغ قطرها صغير، فإنه يمكن بسهولة كسر في المواقع حيث يتم إزالة الطلاء عند فإنه يتم معالجة. وينبغي أن يتم التثبيت شعري في الصك بعناية فائقة.
الخطوات الأساسية المتضمنة في استخدام أسلوب آيس أساسا تتعلق بالإعداد التجري?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الامتنان هارا ماساكوزا (معهد البحوث للعلوم الخضراء والتكنولوجيا، وجامعة شيزوكا، اليابان) لتوفير عينات البروتين AtHIRD11.
Materials
| AtHIRD11 sample | Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) | – | Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli |
| Barefused silica capillary | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | comercially not available anymore | Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G7100A | Capillary electrophoresis instrument |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | Syringe for filtration |
| Rotilabo-syringe filters | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | KY62.1 | PVDF membrane filter for solution filtration |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.023 | Micro pipette for sample handling |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.120 | Micro pipette for handling the ligand solutions |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 08 | Preparing theNaOH solution |
| Bulb pipette 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 14 | Preparing the ligand solution |
| Duran glas volumetric flask 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1457 | Preparing the ligand stock solution |
| Duran glas volumetric flask 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1054 | Preparing the ligand stock solution |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | comercially not available anymore | Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 397229-5G | Electroosmotic flow marker |
| Manganese(II) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 13217 | Ligand |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 431788-100G | Rinsing ingredient |
| Bariumchloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 202738-5G | Ligand |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 71729-100G | Solublizing protein for capillary gel electrophoresis |
| Nickel(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 654507-5G | Ligand |
| Selenium(IV) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 323527-10G | Ligand |
| 2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 252859-100G | Buffer ingredient |
| Zinc(II) chloride | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1088160250 | Ligand |
| Strontium nitrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1078720250 | Ligand |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1371015000 | Ligand |
| 37% hydrochloric acid | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1003171000 | Adjusting pH |
| Copper(II) chloride dihydrate | Riedel-de Haën (Seelze, Germany) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germany) | 10000084;0 | Ultrasonic bath |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G2070-91126 | Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it |
References
- Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
- Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
- Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
- Nachbar, M., et al. Metal ion – dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
- Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
- Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
- Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
- Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
- Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
- Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
- Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
- Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).
