Analyse af AtHIRD11 iboende lidelse og bindende mod metalioner af kapillar gelelektroforese og affinitet kapillær elektroforese
Summary
Denne protokol kombinerer karakterisering af et protein udsnit af kapillar gelelektroforese og en hurtig-bindende screening for opladet ligander af affinitet kapillær elektroforese. Det anbefales for proteiner med en fleksibel struktur, som uløseligt uordnede proteiner, til at bestemme eventuelle forskelle i bindende for forskellige opbygninger.
Abstract
Planter er stærkt afhængige af deres miljø. For at justere stressende ændringer (f.eks., tørke og høj saltholdighed), udvikler højere planter klasser af uløseligt uordnede proteiner (internt fordrevne) kan reducere oxidativ og osmotisk stress. Denne artikel bruger en kombination af kapillar gelelektroforese (CGE) og mobilitet Skift affinitet elektroforese (ACE) for at beskrive den bindende opførsel af forskellige konformere af IDP AtHIRD11 fra Arabidopsis thaliana. CGE bruges til at bekræfte renheden af AtHIRD11 og udelukke fragmenter, posttranslationelle ændringer og andre urenheder som årsager til komplekse peak mønstre. I denne del af forsøget, er forskellige prøve komponenter adskilt af en tyktflydende gel inde en kapillær af deres forskellige masserne og registreret med en diode array detektor. Bagefter, er den bindende opførsel af prøven mod forskellige metalioner undersøgt af ACE. I dette tilfælde liganden føjes til bufferopløsning og skift i migration tid måles for at bestemme om en bindende hændelse har fundet sted eller ej. En af fordelene ved at bruge kombinationen af CGE og es til at bestemme den bindende opførsel af en IDP er mulighed for at automatisere gelelektroforese og bindende assay. Derudover CGE viser en lavere grænse på opdagelse end den klassiske gelelektroforese og es er i stand til at bestemme mulige bindende en ligand på en hurtig måde. Desuden kan ACE også anvendes til andre ladede arter end metalioner. Men brugen af denne metode til bindende eksperimenter er begrænset i sin evne til at bestemme antallet af bindingssteder. Ikke desto mindre, kombinationen af CGE og ACE kan tilpasses for kendetegner bindende adfærd af enhver protein prøve mod talrige opladet ligander.
Introduction
Planter er mere afhængige af deres miljø end mange andre livsformer. Da planter ikke kan flytte til andre steder, har de til at tilpasse sig ændringer i deres omgivelser (f.eks., tørke, kulde og høje salt koncentrationer). Derfor, højere planter udviklet specialiseret stress proteiner som dehydrins, som opfylder mangfoldige opgaver for at reducere celle stress i forbindelse med høj saltholdighed. Disse proteiner binder vand og ioner inde i cellerne, reducere oxidativ stress ved at binde Cu2 +-ioner, og interagere med fosfolipider samt cytoskeletons. Derudover bindende Zn2 +-ioner tillader disse proteiner til at fungere som transkriptionsfaktorer. Deres evne til at binde Ca2 +-ioner efter fosforylering er også blevet rapporteret1.
Den multifunktionelle opførsel af disse proteiner er relateret til manglen hydrofobe aminosyrerester. Derfor, de mangler nogen hydrofobe interaktioner inde peptid kæde og også en begrænset struktur. Men fordi disse proteiner mangler en restriktiv struktur, kan de indtager forskellige opbygninger på samme betingelser. Derfor, de kan beskrives bedst som et ensemble af strukturer og ikke som en enkelt kropsbygning. Proteiner med disse egenskaber er kendt som uløseligt uordnede proteiner (internt fordrevne) og er et udbredt koncept for stress proteiner og krydstale mellem forskellige veje i eukaryote celler2.
En af disse stress-relaterede internt fordrevne er AtHIRD11. Det er en af Arabidopsis thalianade fleste meget tørke-udtrykt internt fordrevne. Derfor, de forskellige konformere kan være adskilt af deres effektive radius at oplade ratio, og kapillær elektroforese (CE) har været anvendt til yderligere undersøgelser. Tidligere ACE eksperimenter viste interaktioner mellem AtHIRD11 og overgang metal ioner som Cu2 +-, Zn2 +-, Co2 +og Ni2 +-ioner. De detaljerede resultater kan findes i Hara et al. 3 og Nachbar et al. 4.
Metoden ACE, der vil blive brugt her bygger på vores tidligere udgivne værker6. Tilsætning af EOF markør acetanilid protein prøven er imidlertid ikke egnet. AtHIRD11 viser bred peak mønstre, og tilføje EOF markør til prøven ville skjule to toppe. Derfor bruges markøren i en separat køre. Før bindende adfærd undersøges, bekræftes det, at toppene fundet under tidligere eksperimenter er fra forskellige opbygninger. Således CGE bruges til at skelne mellem protein konformere, den posttranslationelle modificeret protein og urenheder, som fragmenter af AtHIRD11, af deres forskellige masserne. Efterfølgende er er karakteriseret AtHIRD11 prøven bindende adfærd over for forskellige forskellige metalioner undersøgt.
Formålet med denne artikel er at beskrive en eksperimentel setup at skelne mellem en IDP og andre komponenter i en prøve for at vurdere forskelle i forskellige konformere bindende adfærd.
Protocol
Representative Results
Discussion
For alle CE eksperimenter er forberedelse af kapillar et kritisk skridt. Da det er et glasrør med en lille diameter, kan det nemt bryde på de steder, hvor belægningen fjernes, når det bliver håndteret. Installation af kapillar i instrumentet skal gøres meget omhyggeligt.
De kritiske trin involveret i at bruge metoden ACE hovedsagelig vedrører opsætningen af eksperimenterende. En anden kritisk trin er at finde de rigtige prøve injektion parametre. Injiceres mængden af prøven må vær…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi taknemmelig takker Masakuza Hara (Research Institute af grøn videnskab og teknologi, Universitet i Shizuoka, Japan) for at give AtHIRD11 protein prøver.
Materials
| AtHIRD11 sample | Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) | – | Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli |
| Barefused silica capillary | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | comercially not available anymore | Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G7100A | Capillary electrophoresis instrument |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | Syringe for filtration |
| Rotilabo-syringe filters | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | KY62.1 | PVDF membrane filter for solution filtration |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.023 | Micro pipette for sample handling |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.120 | Micro pipette for handling the ligand solutions |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 08 | Preparing theNaOH solution |
| Bulb pipette 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 14 | Preparing the ligand solution |
| Duran glas volumetric flask 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1457 | Preparing the ligand stock solution |
| Duran glas volumetric flask 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1054 | Preparing the ligand stock solution |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | comercially not available anymore | Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 397229-5G | Electroosmotic flow marker |
| Manganese(II) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 13217 | Ligand |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 431788-100G | Rinsing ingredient |
| Bariumchloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 202738-5G | Ligand |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 71729-100G | Solublizing protein for capillary gel electrophoresis |
| Nickel(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 654507-5G | Ligand |
| Selenium(IV) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 323527-10G | Ligand |
| 2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 252859-100G | Buffer ingredient |
| Zinc(II) chloride | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1088160250 | Ligand |
| Strontium nitrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1078720250 | Ligand |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1371015000 | Ligand |
| 37% hydrochloric acid | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1003171000 | Adjusting pH |
| Copper(II) chloride dihydrate | Riedel-de Haën (Seelze, Germany) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germany) | 10000084;0 | Ultrasonic bath |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G2070-91126 | Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it |
References
- Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
- Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
- Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
- Nachbar, M., et al. Metal ion – dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
- Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
- Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
- Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
- Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
- Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
- Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
- Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
- Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).
