AtHIRD11 आंतरिक विकार का विश्लेषण और धातु आयनों की ओर बाध्यकारी केशिका जेल ट्रो और अपनत्व केशिका ट्रो
Summary
इस प्रोटोकॉल केशिका जेल ट्रो द्वारा एक प्रोटीन नमूने के लक्षण वर्णन को जोड़ती है और एक तेजी से बाध्यकारी लाइगैंडों द्वारा आरोपित के लिए स्क्रीनिंग संबध केशिका ट्रो । यह एक लचीला संरचना के साथ प्रोटीन के लिए सिफारिश की है, जैसे आंतरिक रूप से परिक्रमा प्रोटीन, अलग अनुरूपता के लिए बाध्यकारी में कोई अंतर निर्धारित करने के लिए ।
Abstract
पौधे अपने पर्यावरण पर दृढ़ता से निर्भर रहते हैं । तनावपूर्ण परिवर्तन (जैसे, सूखा और उच्च लवणता) को समायोजित करने के लिए, उच्च संयंत्रों ऑक्सीडेटिव और आसमाटिक तनाव को कम करने के लिए आंतरिक रूप से परिक्रमा प्रोटीन (IDPs) की कक्षाएं विकसित । यह आलेख केशिका जेल ट्रो (CGE) और गतिशीलता बदलाव संबध ट्रो (ऐस) का एक संयोजन का उपयोग करता है क्रम में AtHIRD11Arabidopsis से IDP थालियाना के विभिन्न क्षेऽ के बंधन व्यवहार का वर्णन करने के लिए । CGE AtHIRD11 की शुद्धता की पुष्टि करने के लिए और टुकड़े, posttranslational संशोधनों, और जटिल चोटी पैटर्न के लिए कारणों के रूप में अंय अशुद्धियों को बाहर करने के लिए प्रयोग किया जाता है । प्रयोग के इस भाग में, विभिन्न नमूना घटकों उनके विभिन्न द्रव्यमान द्वारा एक केशिका के अंदर एक चिपचिपा जेल द्वारा अलग कर रहे हैं और एक डायोड सरणी डिटेक्टर के साथ पता चला. इसके बाद, विभिंन धातु आयनों की ओर नमूना के बंधन व्यवहार इक्का द्वारा जांच की है । इस स्थिति में, ligand बफ़र समाधान करने के लिए जोड़ा गया है, और माइग्रेशन समय में shift एक बाइंडिंग इवेंट उत्पन्न हुई है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए मापा जाता है । एक IDP के बंधन व्यवहार का निर्धारण करने के लिए CGE और इक्का के संयोजन का उपयोग करने के लाभों में से एक संभावना को स्वचालित जेल ट्रो और बाध्यकारी परख है । इसके अलावा, CGE शास्त्रीय जेल ट्रो से पता लगाने की एक कम सीमा से पता चलता है और इक्का एक तेजी से तरीके से एक ligand बंधन के तरीके को निर्धारित करने में सक्षम है । इसके अलावा, ऐस भी धातु आयनों से अंय आरोप लगाया प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है । हालांकि, बाध्यकारी प्रयोगों के लिए इस विधि का उपयोग बाइंडिंग साइटों की संख्या निर्धारित करने की क्षमता में सीमित है । फिर भी, CGE और इक्का के संयोजन निस्र्पक के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कई आरोप लगाया लाइगैंडों के प्रति कोई प्रोटीन नमूना के बंधन व्यवहार ।
Introduction
पौधे कई अन्य जीवन रूपों की तुलना में अपने पर्यावरण पर अधिक निर्भर होते हैं । के बाद से पौधों को अंय स्थानों पर नहीं ले जा सकते हैं, वे अपने परिवेश में परिवर्तन के लिए समायोजित किया है (जैसे, सूखा, ठंडा और उच्च नमक सांद्रता) । नतीजतन, उच्च संयंत्रों dehydrins है, जो कई गुना कार्य पूरा करने सेल तनाव को कम करने की तरह विशेष तनाव प्रोटीन विकसित उच्च लवणता से संबंधित । इन प्रोटीनों के अंदर कोशिकाओं पानी और आयनों बांध, घन2 +-आयनों बाध्यकारी द्वारा ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करने, और साथ ही cytoskeletons फॉस्फोलिपिड के साथ बातचीत । इसके अलावा, बाध्यकारी Zn2 +-आयनों इन प्रोटीन प्रतिलेखन कारकों के रूप में कार्य करने के लिए अनुमति देता है । फास्फारिलीकरण के बाद Ca2 +-आयनों को बाइंड करने की उनकी क्षमता भी सूचित किया गया है1.
इन प्रोटीन के बहुआयामी व्यवहार hydrophobic एमिनो एसिड अवशेषों के अभाव से संबंधित है । नतीजतन, वे पेप्टाइड श्रृंखला के अंदर किसी भी hydrophobic बातचीत और भी एक विवश संरचना की कमी है । हालांकि, क्योंकि इन प्रोटीन एक प्रतिबंधात्मक संरचना की कमी है, वे एक ही परिस्थितियों में विभिंन सुधारवादी कब्जा कर सकते हैं । इसलिए, वे संरचनाओं के एक पहनावा के रूप में सबसे अच्छा बताया जा सकता है बजाय एक एकल रचना के रूप में । इन गुणों के साथ प्रोटीन आंतरिक रूप से परिक्रमा प्रोटीन (IDPs) के रूप में जाना जाता है और तनाव प्रोटीन और eukaryotic कोशिकाओं2में विभिंन रास्ते के बीच crosstalk के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल की अवधारणा कर रहे हैं ।
इनमें से एक तनाव से संबंधित IDPs AtHIRD11 है । यह Arabidopsis थालियानाके सबसे अत्यधिक सूखा-व्यक्त IDPs में से एक है । इसलिए, विभिंन संरचनाओं के अनुपात को चार्ज करने के लिए अपने प्रभावी त्रिज्या से अलग किया जा सकता है, और केशिका ट्रो (CE) आगे की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है । पिछले इक्का प्रयोगों घन2+-, Zn2+-, सह2+, और Ni2 +-आयनों के रूप में AtHIRD11 और संक्रमण धातु आयनों के बीच बातचीत का प्रदर्शन किया । विस्तृत परिणामों में पाया जा सकता है हारा एट अल । 3 और Nachbar एट अल. 4.
इक्का विधि है कि यहां इस्तेमाल किया जाएगा हमारे पहले प्रकाशित काम करता है6पर आधारित है । हालांकि, प्रोटीन के नमूने के लिए EOF मार्कर acetanilide के अलावा उपयुक्त नहीं है । AtHIRD11 व्यापक पीक पैटर्न से पता चलता है, और नमूने के लिए EOF मार्कर जोड़ने दो चोटियों छिपाने होगा. इसलिए, मार्कर एक अलग रन में प्रयोग किया जाता है । इससे पहले कि बाध्यकारी व्यवहार की जांच की जाती है, इस बात की पुष्टि की जाती है कि पिछले प्रयोगों के दौरान पाई गई चोटियों की रचनाएं विभिन्न रूप से होती हैं । इस प्रकार, CGE प्रोटीन अनुरूपता के बीच अंतर करने के लिए प्रयोग किया जाता है, के बाद अनुवाद संशोधित प्रोटीन, और अशुद्धियों, AtHIRD11 के टुकड़े के रूप में, उनके विभिन्न जनता द्वारा. बाद में, विभिंन विभिंन धातु आयनों की ओर विशेषता AtHIRD11 नमूना है बाध्यकारी व्यवहार की जांच की है ।
इस अनुच्छेद के प्रयोजन के लिए एक प्रयोगात्मक सेटअप का वर्णन करने के लिए एक IDP और एक नमूना के अंय घटकों के बीच अंतर करने के क्रम में विभिंन क्षेऽ के बंधन व्यवहार में अंतर का मूल्यांकन है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
सभी CE प्रयोगों के लिए, केशिका की तैयारी एक महत्वपूर्ण कदम है । चूंकि यह एक छोटे व्यास के साथ एक ग्लास ट्यूब है, यह आसानी से धब्बे जहां कोटिंग हटा दिया जाता है जब यह संभाला जा रहा है पर टूट सकता है । उपकरण मे?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम आभारी धंयवाद Masakuza हारा (ग्रीन विज्ञान और प्रौद्योगिकी के अनुसंधान संस्थान, Shizuoka विश्वविद्यालय, जापान) AtHIRD11 प्रोटीन नमूने प्रदान करने के लिए ।
Materials
| AtHIRD11 sample | Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) | – | Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli |
| Barefused silica capillary | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | comercially not available anymore | Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G7100A | Capillary electrophoresis instrument |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | Syringe for filtration |
| Rotilabo-syringe filters | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | KY62.1 | PVDF membrane filter for solution filtration |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.023 | Micro pipette for sample handling |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.120 | Micro pipette for handling the ligand solutions |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 08 | Preparing theNaOH solution |
| Bulb pipette 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 14 | Preparing the ligand solution |
| Duran glas volumetric flask 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1457 | Preparing the ligand stock solution |
| Duran glas volumetric flask 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1054 | Preparing the ligand stock solution |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | comercially not available anymore | Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 397229-5G | Electroosmotic flow marker |
| Manganese(II) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 13217 | Ligand |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 431788-100G | Rinsing ingredient |
| Bariumchloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 202738-5G | Ligand |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 71729-100G | Solublizing protein for capillary gel electrophoresis |
| Nickel(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 654507-5G | Ligand |
| Selenium(IV) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 323527-10G | Ligand |
| 2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 252859-100G | Buffer ingredient |
| Zinc(II) chloride | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1088160250 | Ligand |
| Strontium nitrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1078720250 | Ligand |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1371015000 | Ligand |
| 37% hydrochloric acid | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1003171000 | Adjusting pH |
| Copper(II) chloride dihydrate | Riedel-de Haën (Seelze, Germany) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germany) | 10000084;0 | Ultrasonic bath |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G2070-91126 | Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it |
References
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