AtHIRD11 내장 장애 및 모 세관 젤 전기 이동 법 및 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 금속 이온으로 바인딩 분석

Summary

이 프로토콜 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 모 세관 젤 전기 이동 법 및 충전된 ligands에 대 한 빠른 바인딩 심사를 단백질 샘플의 특성을 결합합니다. 그것은 본질적으로 무질서 단백질 등 유연한 구조를 가진 단백질에 대 한 다른 conformers에 대 한 바인딩 차이 확인 하려면 권장.

Abstract

식물은 강하게 그들의 환경에 따라 달라 집니다. 스트레스 변화 (예:가뭄, 높은 염 분)을 조정 하기 위하여 더 높은 식물 진화 산화 및 삼투성 스트레스를 줄이기 위해 본질적으로 무질서 단백질 (IDPs)의 클래스. 이 문서는 애기 thaliana에서 IDP AtHIRD11의 다른 conformers의 바인딩 동작을 설명 하기 위해 모 세관 젤 전기 이동 법 (CGE)와 이동성 교대 선호도 전기 이동 법 (ACE)를 사용 합니다. CGE는 AtHIRD11의 순도 확인 하 고 복잡 한 피크 패턴에 대 한 이유로 서 조각, posttranslational 수정 및 기타 불순물을 제외 하는 데 사용 됩니다. 실험의이 부분에서 다른 샘플 구성 요소는 그들의 다른 대 중에 의해 모 세관 내부 점성 젤으로 구분 하 고 다이오드 배열 검출기 감지. 그 후, 다양 한 금속 이온으로 샘플의 바인딩 동작은 에이스에 의해 조사 하 고 있다. 이 경우에 ligand 버퍼 솔루션에 추가 되 고 마이그레이션 시간에 변화 여부 바인딩 이벤트 발생 여부를 결정 하기 위하여 측정 된다. CGE와 에이스의 조합 IDP의 바인딩 동작을 사용 하 여의 장점 중 하나는 젤 전기 이동 법 및 바인딩 분석 결과를 자동화 가능성입니다. 또한, CGE 고전 젤 전기 이동 법 보다 탐지의 하한값을 보여줍니다 이며 에이스 빠른 방법에 있는 ligand 바인딩 방식으로 확인할 수 있습니다. 또한, 에이스 금속 이온 보다 다른 청구 종에도 적용할 수 있습니다. 그러나, 실험 바인딩에 대 한이 메서드를 사용 하 여 바인딩 사이트 수를 결정 하는 기능에 제한 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, CGE와 에이스의 조합 다 충전된 ligands 향해 어떤 단백질 샘플의 바인딩 동작을 특성화에 대 한 적응 될 수 있다.

Introduction

식물은 다른 많은 생명체 보다 자신의 환경에 더 의존. 때문에 식물은 다른 곳으로 이동할 수 없습니다, 그들은 변화 (예를 들면, 가뭄, 추위와 높은 소금 농도) 그들의 주위에 있다. 따라서, 더 높은 식물 dehydrins, 높은 염 분에 관련 된 세포 스트레스를 줄이기 위해 다양 한 작업을 수행 같은 전문된 스트레스 단백질을 개발 했다. 이 단백질 셀 안에 물과 이온 바인딩, 바인딩 Cu^{2 +}로 산화 스트레스를 감소-이온, 인지질으로는 cytoskeletons와 상호 작용 하는 고. 또한, 바인딩 Zn^{2 +}-이온이이 단백질 녹음 방송 요인의 역할을 수 있습니다. 그들의 능력을 바인딩할 캘리포니아^{2 +}-이온 인 산화 또한 후 보고¹.

이 단백질의 다기능 동작 소수 성 아미노산 잔류물의 부재와 관련이 있습니다. 따라서, 그들은 부족 펩 티 드 사슬 및 또한 제한 구조 내부의 소수 성 상호 작용. 그러나, 이러한 단백질 부족 제한적인 구조, 때문에 그들은 동일한 조건 하에서 다른 conformers 차지할 수 있습니다. 따라서, 그들은 설명할 수 있습니다 최고의 단일 구조 아니라 구조의 앙상블. 이러한 속성 가진 단백질 단백질 (IDPs) 본질적으로 무질서 하 고 스트레스 단백질 및 진 핵 세포²다른 통로 사이 누화에 대 한 널리 사용 되는 개념으로 알려져 있다.

이러한 스트레스 관련 IDPs 중 하나는 AtHIRD11입니다. 그것은 대부분 매우 가뭄 표현 IDPs 애기 thaliana중 하나입니다. 따라서, 다른 conformers 충전 비율, 그들의 효과적인 반경으로 분리 될 수 있다 그리고 모 세관 전기 이동 법 (세 륨) 추가 수사를 위해 사용 되었습니다. 이전 에이스 실험 AtHIRD11와 Cu^{2 +}-, Zn^{2 +}-, Co^{2 +}및 Ni^{2 +}같은 전이 금속 이온 간의 상호 작용을 시연-이온. 하 라 외 에 상세한 결과 찾을 수 있습니다. ³ 그리고 Nachbar 외. ⁴.

에이스 메서드를 여기에서 사용 될 것입니다 우리의 이전 저서⁶을 기반으로 합니다. 그러나, 단백질 견본을 EOF 표식 acetanilide 추가 적합 하지 않습니다. AtHIRD11 넓은 피크 패턴을 표시 하 고 두 봉우리를 위장 것 샘플에 EOF 표식 추가. 따라서, 표시자는 별도 실행에 사용 됩니다. 바인딩 동작을 검사 하기 전에 그것에서 다른 conformers 이전 실험 중에 발견 하는 봉우리는 확인 된다. 따라서, CGE는 단백질 conformers 사이 구별 하는 데 사용 됩니다는 포스트 번역 상 수정 단백질, 및 그들의 다른 대 중에 의해 AtHIRD11의 조각 같은 불순물. 그 후, 다양 한 다른 금속 이온으로 특징이 AtHIRD11 샘플의 바인딩 동작 조사 이다.

이 문서의 목적은 다른 conformers의 바인딩 동작에 차이 평가 하기 위해 IDP와 샘플의 다른 구성 요소를 구분 하는 실험 설치를 설명 하는 것입니다.

Protocol

1입니다. 모 세관 전기 이동 법 장비의 준비 모세를 준비 유리 커터를 사용 하 여 잘라 베어-융합 된 실리 카 폴 외부 코팅 및 50 µ m의 내부 직경 모 세관 (CGE 실험)에 대 한 33 cm과 30 cm (에이스 실험)에 대 한 긴 모세 혈관. 유리 접시에 절단을 수행 합니다.참고: 2 다른 실험 설정 2 가지 악기에 대 한 개발 되었다. 을 다른 악기에 그들을 사용 하려면 적절 한 방법을 전송…

Representative Results

그림 1 에서는 CGE 실험 기간 동안 얻은 AtHIRD11 샘플에 대 한 electropherogram. 펩 티 드 크기 왼쪽에서 오른쪽으로 증가합니다. 최대 수 4 큰 질량은 고 그대로 단백질을 나타냅니다. 작은 봉우리 2와 3는 작은 불순물을 (예, 저하 제품)를 나타냅니다. 첫 번째 피크와 전에 기준선의 불일치 또한 단백질 샘플 없이 재현 수 있습니다. 따라서, 그것은 관련…

Discussion

모든 CE 실험, 모 세관의 준비는 중요 한 단계 이다. 작은 직경을 가진 유리 튜브 때문에, 처리 되 고 때 코팅을 제거 하는 관광 명소에 쉽게 끊을 수 있다. 에 모 세관의 설치는 매우 신중 하 게 이루어져야 한다.

주로 에이스 메서드를 사용 하 여 중요 한 단계는 실험적인 체제에 관계 한다. 다른 중요 한 단계는 오른쪽 샘플 주입 매개 변수를 찾아내고 있다. 샘플의 주입된 양을 …

Materials

AtHIRD11 sample	Shizuoka University (Group Prof. M. Hara)	–	Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillary	Polymicro Technologies (Phoenix, USA)	106815-0017	TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600A	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	comercially not available anymore	Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead
Agilent 7100 CE	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	G7100A	Capillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mL	B. Braun (Melsungen, Germany)	4606051V	Syringe for filtration
Rotilabo-syringe filters	Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany)	KY62.1	PVDF membrane filter for solution filtration
Eppendorf Research plus 10 μL	Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)	3121 000.023	Micro pipette for sample handling
Eppendorf Research plus 10 μL	Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)	3121 000.120	Micro pipette for handling the ligand solutions
Bulb pipette 10 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 338 08	Preparing theNaOH solution
Bulb pipette 25 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 338 14	Preparing the ligand solution
Duran glas volumetric flask 25 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 671 1457	Preparing the ligand stock solution
Duran glas volumetric flask 10 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 671 1054	Preparing the ligand stock solution
Proteome Lab SDS MW Gel Buffer	Beckman Coulter (Brea, USA)	comercially not available anymore	Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032
Acetanilide	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	397229-5G	Electroosmotic flow marker
Manganese(II) chloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	13217	Ligand
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	431788-100G	Rinsing ingredient
Bariumchloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	202738-5G	Ligand
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	71729-100G	Solublizing protein for capillary gel electrophoresis
Nickel(II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	654507-5G	Ligand
Selenium(IV) chloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	323527-10G	Ligand
2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	252859-100G	Buffer ingredient
Zinc(II) chloride	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1088160250	Ligand
Strontium nitrate	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1078720250	Ligand
Calcium chloride dihydrate	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1371015000	Ligand
37% hydrochloric acid	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1003171000	Adjusting pH
Copper(II) chloride dihydrate	Riedel-de Haën (Seelze, Germany)	31286	Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L	Allpax (Papenburg, Germany)	10000084;0	Ultrasonic bath
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	G2070-91126	Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it