Analyse av AtHIRD11 iboende forstyrrelse og bindende mot metall ioner av kapillær Gel gelelektroforese og affinitet kapillært geleelektroforese
Summary
Denne protokollen kombinerer karakterisering av et protein utvalg av kapillær gel gelelektroforese og en rask-bindende screening for ladet ligander ved affinitet kapillært geleelektroforese. Det anbefales for proteiner med en fleksibel struktur, som egentlig uordnede proteiner, å avgjøre eventuelle forskjeller i bindingen for forskjellige conformers.
Abstract
Planter er sterkt avhengig av miljøet. For å justere stressende endringer (f.eks, tørke og hřy salinitet), utvikles høyere planter klasser av egentlig uordnede proteiner (internt fordrevne) å redusere osmotisk og oksidativt stress. Denne artikkelen bruker en kombinasjon av kapillær gel gelelektroforese (CGE) og mobilitet Skift affinitet geleelektroforese (ACE) for å beskrive bindende atferden til ulike conformers av IDP-AtHIRD11 fra Arabidopsis thaliana. CGE brukes til å bekrefte renheten av AtHIRD11 og utelate fragmenter, posttranslational modifikasjoner og andre urenheter som årsaker til komplekse topp mønstre. I denne delen av eksperimentet, er forskjellige utvalg komponentene atskilt med en tyktflytende gel inne en kapillær av deres forskjellige massene og oppdaget med en diode array detektor. Etterpå er bindende virkemåten av prøven mot ulike metall ioner undersøkt av ACE. I dette tilfellet ligand legges til buffer løsning og skifte i overføringstid måles for å fastslå om en bindende hendelse har skjedd eller ikke. En av fordelene med å bruke kombinasjonen av CGE og ess til Renseinnstillingene bindende en IDP er muligheten til å automatisere gel gelelektroforese og bindende analysen. Videre CGE viser en nedre grense for påvisning enn klassisk gel geleelektroforese og ess er kjøpedyktig fastsette slags binding en ligand på en rask måte. I tillegg kan ess også brukes til andre ladet arter enn metall ioner. Men er bruk av denne metoden for bindende eksperimenter begrenset i sin evne til å bestemme antall bindende. Likevel, kombinasjonen av CGE og ess kan tilpasses for å karakterisere bindende virkemåten til enhver protein prøven mot mange ladet ligander.
Introduction
Planter er mer avhengig av miljøet enn mange andre livsformer. Siden planter ikke kan flytte til andre steder, må de justere endringer i deres omgivelser (f.eks, tørke, kald og høy salt konsentrasjoner). Derfor utviklet høyere planter spesialiserte stress proteiner som dehydrins, som oppfyller mange oppgaver for å redusere celle stress relatert til høyt salt. Disse proteinene binde vann og ioner i cellene, redusere oksidativt stress ved å binde Cu2 +-ioner, og samhandle med fosfolipider som cytoskeletons. Videre bindende Zn2 +-ioner lar disse proteinene som transkripsjonsfaktorer. Deres evne til å binde Ca2 +-ioner etter fosforylering har også vært rapportert1.
Multifunksjonelle virkemåten til disse proteinene er relatert til fravær av hydrofobe aminosyre rester. Derfor mangler de noen hydrofobe interaksjoner innenfor peptid kjeden samt en begrenset struktur. Fordi disse proteinene mangler en restriktiv struktur, kan de imidlertid oppta forskjellige conformers under like forhold. Derfor kan de beskrives best som et ensemble av strukturer i stedet for en enkelt konformasjon. Proteiner med disse egenskapene er kjent som egentlig uordnede proteiner (internt fordrevne) og er en mye brukt begrep for stress proteiner og crosstalk mellom forskjellige baner i eukaryote celler2.
En av disse stress-relaterte internflyktninger er AtHIRD11. Det er en av Arabidopsis thalianade fleste svært tørke-uttrykt internflyktninger. Derfor de forskjellige conformers kan skilles av deres effektiv radius lade forholdet, og capillary geleelektroforese (CE) har blitt brukt for videre undersøkelser. Tidligere ess eksperimenter vist samspillet mellom AtHIRD11 og overgang metall ioner som Cu2 +– Zn2 +-, Co2 +og Ni2 +-ioner. Den detaljerte resultatet finner du i Hara et al. 3 og Nachbar et al. 4.
ACE metoden som brukes her er basert på våre tidligere publiserte arbeider6. Men er tillegg av EOF markør acetanilide til protein prøven ikke egnet. AtHIRD11 viser bred topp mønstre og legge EOF markøren til prøven vil skjule to toppene. Derfor brukes markøren i en separat. Før bindingen virkemåten er undersøkt, er det bekreftet at toppene funnet under forrige eksperimenter er fra ulike conformers. Dermed CGE brukes til å skille mellom protein conformers, det post-translasjonell endret protein og urenheter, som fragmenter av AtHIRD11, av deres forskjellige massene. Deretter er preget AtHIRD11 prøvens bindende oppførsel mot ulike ulike metall ioner undersøkt.
Formålet med denne artikkelen er å beskrive en eksperimentelle oppsett for å skille mellom en IDP og andre komponenter i et utvalg for å vurdere forskjellene i bindingen virkemåten til forskjellige conformers.
Protocol
Representative Results
Discussion
For alle CE eksperimenter er utarbeidelse av av kapillær en avgjørende skritt. Siden det er røret med liten diameter, kan det lett bryte på stedene hvor belegget fjernes når den blir behandlet. Installasjon av av kapillær inn i apparatet bør gjøres veldig nøye.
Kritisk trinnene involvert i med metoden ACE hovedsakelig forbundet eksperimentelle oppsettet. Et annet viktig skritt er å finne rett eksempel injeksjon parameterne. Den injiserte utvalget har å være nok for høye topper. Im…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takknemlig takk Masakuza Hara (Research Institute for Green vitenskap og teknologi, Universitetet Shizuoka, Japan) for å gi AtHIRD11 protein prøvene.
Materials
| AtHIRD11 sample | Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) | – | Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli |
| Barefused silica capillary | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | comercially not available anymore | Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G7100A | Capillary electrophoresis instrument |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | Syringe for filtration |
| Rotilabo-syringe filters | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | KY62.1 | PVDF membrane filter for solution filtration |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.023 | Micro pipette for sample handling |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.120 | Micro pipette for handling the ligand solutions |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 08 | Preparing theNaOH solution |
| Bulb pipette 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 14 | Preparing the ligand solution |
| Duran glas volumetric flask 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1457 | Preparing the ligand stock solution |
| Duran glas volumetric flask 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1054 | Preparing the ligand stock solution |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | comercially not available anymore | Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 397229-5G | Electroosmotic flow marker |
| Manganese(II) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 13217 | Ligand |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 431788-100G | Rinsing ingredient |
| Bariumchloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 202738-5G | Ligand |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 71729-100G | Solublizing protein for capillary gel electrophoresis |
| Nickel(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 654507-5G | Ligand |
| Selenium(IV) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 323527-10G | Ligand |
| 2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 252859-100G | Buffer ingredient |
| Zinc(II) chloride | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1088160250 | Ligand |
| Strontium nitrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1078720250 | Ligand |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1371015000 | Ligand |
| 37% hydrochloric acid | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1003171000 | Adjusting pH |
| Copper(II) chloride dihydrate | Riedel-de Haën (Seelze, Germany) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germany) | 10000084;0 | Ultrasonic bath |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G2070-91126 | Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it |
References
- Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
- Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
- Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
- Nachbar, M., et al. Metal ion – dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
- Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
- Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
- Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
- Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
- Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
- Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
- Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
- Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).
