Анализ AtHIRD11 внутренние беспорядки и привязки к ионов металлов Капиллярный электрофорез и близость капиллярного электрофореза
Summary
Этот протокол сочетает в себе характеристики образец протеина Капиллярный электрофорез и быстро привязки скрининга для заряженных лигандов, близость капиллярного электрофореза. Рекомендуется для белков с гибкой структурой, например неразрывно неупорядоченных белки, чтобы определить какие-либо различия в привязке для различных конформеров.
Abstract
Растения сильно зависят от окружающей их среды. Для того, чтобы приспособиться к стрессовым изменениям (например, засухи и высокой солености), высших растений развиваться классы неразрывно неупорядоченных белков (ВПЛ) для уменьшения окислительного и осмотического стресса. Эта статья использует комбинацию Капиллярный электрофорез (КГЭ) и мобильность сдвиг сродство электрофореза (ACE), чтобы описать поведение привязки различных конформеров AtHIRD11 ВПЛ из Arabidopsis thaliana. КГЭ используется для подтверждения чистоты AtHIRD11 и исключить фрагменты, Посттрансляционная изменений и других примесей, как причин для сложных пик шаблонов. В этой части эксперимента различные примеры компонентов разделенных их различных масс вязкой гелем внутри капилляра и обнаружены с детектором массив диода. Потом ACE исследуется поведение привязки образца к различных ионов металлов. В этом случае лигандом добавляется буферного раствора и сдвиг в миграции время измеряется для того, чтобы определить, произошло ли событие привязки или нет. Одним из преимуществ использования комбинации КГЭ и ACE определить поведение привязки МВУ является возможность автоматизировать электрофорез геля и пробирного привязки. Кроме того КГЭ показывает нижний предел обнаружения, чем классические гель-электрофорез и туз может определить порядок привязки лиганд в быстром образе. Кроме того ACE также может применяться для других заряженных видов чем ионы металла. Однако использование этого метода для привязки эксперименты ограничен в его способность определить количество сайтов связывания. Тем не менее сочетание КГЭ и туз может быть адаптирована для характеризующие поведение привязки любой образец протеина к многочисленные заряженных лигандами.
Introduction
Растения являются более зависимыми от их окружающей среды, чем многие другие формы жизни. Поскольку растения не может переехать в другие места, они должны адаптироваться к изменениям в их окружении (например, засухи, холодной и высокая концентрация соли). Следовательно высших растений разработана специализированная стресс белки как дегидринов, которые выполняют многообразные задачи, чтобы уменьшить стресс ячейки, относящиеся к высокой солености. Эти белки связывают воды и ионов внутри клеток, уменьшить окислительный стресс путем привязки Cu2 +-ионов и взаимодействовать с фосфолипидами, а также cytoskeletons. Кроме того, привязка Zn2 +-ионов позволяет эти белки выступают в качестве факторов транскрипции. Их способность фиксироваться Ca2 +-ионов после фосфорилирования был также сообщили1.
Многофункциональный поведение этих белков связана с отсутствием гидрофобные аминокислотных остатков. Следовательно им не хватает любой гидрофобных взаимодействий внутри пептидные цепи, а также ограничением структуры. Однако потому что эти белки отсутствие ограничительного структуры, они могут занимать различные конформеров на тех же условиях. Таким образом они могут быть описаны лучшие, как ансамбль сооружений, а не один конформации. Белки с этими свойствами известны как внутренне неупорядоченным белков (ВПЛ) и широко используется понятие стресса белков и перекрестных помех между различными путями в эукариотической клетки2.
Один из этих связанных со стрессом ВПЛ является AtHIRD11. Это один из Arabidopsis thalianaнаиболее высоко засухи выразил ВПЛ. Следовательно различные конформеров могут быть разделены их эффективный радиус для зарядки соотношение и капиллярного электрофореза (CE) был использован для дальнейшего расследования. Предыдущие эксперименты ACE продемонстрировал взаимодействия между AtHIRD11 и ионов переходных металлов таких как Cu2 +-, Zn2 +-, Co2 +и Ni2 +-ионов. Подробные результаты можно найти в Хара и др. 3 и Люберцах и др. 4.
ACE метод, который будет использоваться здесь основан на нашей ранее опубликованных работ6. Однако добавление acetanilide маркер EOF для Образец протеина не подходит. AtHIRD11 показывает широкий пик шаблоны, и добавление метки EOF образца будет замаскировать две вершины. Таким образом маркер используется в отдельном сеансе. Прежде чем рассматривается поведение привязки, он подтвердил, что пики, найденные во время предыдущих экспериментов являются из разных конформеров. Таким образом КГЭ используется для различения между конформеров белка, столб-поступательные изменения протеина и примесей, таких как фрагменты AtHIRD11, их разными массами. Впоследствии Исследовано поведение характеризуется AtHIRD11 Пример привязки к различных различных ионов металлов.
Целью этой статьи является описание экспериментальной установки для различения МВУ и другие компоненты образца для того чтобы оценить различия в поведении привязки различных конформеров.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для всех CE экспериментов подготовка капилляра является важным шагом. Поскольку это стеклянную трубку с малого диаметра, он может легко сломать в местах, где покрытие удаляется, когда он обрабатывается. Установка капилляра, в инструмент следует делать очень осторожно.
Ва?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признательны поблагодарить Masakuza Хара (исследовательский институт зеленый науки и технологий, Университет Шизуока, Япония) для предоставления образцов белка AtHIRD11.
Materials
| AtHIRD11 sample | Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) | – | Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli |
| Barefused silica capillary | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | comercially not available anymore | Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G7100A | Capillary electrophoresis instrument |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | Syringe for filtration |
| Rotilabo-syringe filters | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | KY62.1 | PVDF membrane filter for solution filtration |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.023 | Micro pipette for sample handling |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.120 | Micro pipette for handling the ligand solutions |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 08 | Preparing theNaOH solution |
| Bulb pipette 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 14 | Preparing the ligand solution |
| Duran glas volumetric flask 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1457 | Preparing the ligand stock solution |
| Duran glas volumetric flask 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1054 | Preparing the ligand stock solution |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | comercially not available anymore | Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 397229-5G | Electroosmotic flow marker |
| Manganese(II) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 13217 | Ligand |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 431788-100G | Rinsing ingredient |
| Bariumchloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 202738-5G | Ligand |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 71729-100G | Solublizing protein for capillary gel electrophoresis |
| Nickel(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 654507-5G | Ligand |
| Selenium(IV) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 323527-10G | Ligand |
| 2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 252859-100G | Buffer ingredient |
| Zinc(II) chloride | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1088160250 | Ligand |
| Strontium nitrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1078720250 | Ligand |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1371015000 | Ligand |
| 37% hydrochloric acid | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1003171000 | Adjusting pH |
| Copper(II) chloride dihydrate | Riedel-de Haën (Seelze, Germany) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germany) | 10000084;0 | Ultrasonic bath |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G2070-91126 | Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it |
References
- Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
- Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
- Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
- Nachbar, M., et al. Metal ion – dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
- Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
- Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
- Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
- Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
- Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
- Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
- Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
- Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).
