Analys av AtHIRD11 inneboende sjukdom och bindande mot metalljoner genom kapillär gelelektrofores och affinitet kapillärelektrofores
Summary
Detta protokoll kombinerar karakterisering av ett protein prov genom kapillär gelelektrofores och en snabb-bindande screening för laddade ligander av affinitet kapillärelektrofores. Det rekommenderas för proteiner med en flexibel struktur, såsom oupplösligt oordnade proteiner, att fastställa eventuella skillnader i bindande för olika konformationer.
Abstract
Växter är starkt beroende av sin omgivning. För att anpassa sig till påfrestande förändringar (t.ex., torka och hög salthalt), utvecklas högre växter klasser av egensäkra oordnade proteiner (internflyktingar) att minska oxidativ och osmotisk stress. Denna artikel använder en kombination av kapillär gelelektrofores (CGE) och rörlighet Skift affinitet elektrofores (ACE) för att beskriva beteendet bindande med olika konformationer av de IDP AtHIRD11 från Arabidopsis thaliana. CGE används för att bekräfta AtHIRD11 renhet och att utesluta fragment, posttranslationell ändringar och andra orenheter som skäl för komplexa peak mönster. I denna del av experimentet, olika prov komponenterna separeras av en trögflytande gel inuti en kapillär genom deras olika massa och identifieras med en diod array detektor. Efteråt, utreds bindande beteendet av provet mot olika metalljoner av ACE. I det här fallet liganden läggs till buffertlösningen och förskjutningen i flyttningstid mäts för att fastställa huruvida en bindande händelse har inträffat eller inte. En av fördelarna med att använda kombinationen av CGE och ACE för att fastställa bindande beteendet för en IDP är möjligheten att automatisera gelelektrofores och bindande analysen. Dessutom CGE visar en lägre detektionsgräns än den klassiska gelelektrofores och ACE är kunna avgöra sättet bindande en ligand på ett snabbt sätt. Dessutom kan ACE också tillämpas på andra laddade arter än metalljoner. Användningen av denna metod för bindande experiment begränsas emellertid i dess förmåga att bestämma antalet bindningsställen. Kombinationen av CGE och ACE kan dock anpassas för kännetecknar bindande beteendet hos varje protein prov mot många laddade ligander.
Introduction
Växter är mer beroende av omgivningen än många andra livsformer. Eftersom växterna inte kan flytta till andra platser, har de att anpassa sig till förändringar i omgivningen (t.ex., torka, kyla och hög salt koncentrationer). Följaktligen utvecklat högre växter specialiserade stress proteiner som dehydrins, som fullgör mångfaldiga uppgifter för att minska cell stress relaterade till hög salthalt. Dessa proteiner binder vatten och joner inuti cellerna, minska oxidativ stress genom bindande Cu2 +-joner, och interagera med fosfolipider samt cytoskeletons. Dessutom bindande Zn2 +-joner tillåter dessa proteiner att agera som transkriptionsfaktorer. Deras förmåga att binda Ca2 +-joner efter fosforylering har också rapporterat1.
Multifunktionell uppförandet av dessa proteiner är relaterad till avsaknad av hydrofoba aminosyror rester. Följaktligen saknar de hydrofoba interaktioner inuti peptid kedjan och även en begränsad struktur. Men eftersom dessa proteiner saknar en restriktiv struktur, kan de upptar olika konformationer på samma villkor. Därför, de kan beskrivas bäst som en ensemble av strukturer snarare än en enda konformation. Proteiner med dessa egenskaper är kända som egensäkra andningsstörningar proteiner (internflyktingar) och är en allmänt använd koncept för stress proteiner och överhörning mellan olika vägar i eukaryota celler2.
En av dessa stressrelaterade internflyktingar är AtHIRD11. Det är en av Arabidopsis thaliana’smest mycket torka-uttryckta internflyktingar. Därför de olika konformationer kan separeras genom deras effektiva radien att debitera baserat, och kapillärelektrofores (CE) har använts för vidare utredning. Tidigare ACE experiment visat samspelet mellan AtHIRD11 och övergång metall joner såsom Cu2 +-, Zn2 +-, Co2 +och Ni2 +-joner. Resultaten kan hittas i Hara o.a. 3 och Nachbar o.a. 4.
Metoden ess som kommer att användas här bygger på vår tidigare publicerade verk6. Tillägg av den EOF markör acetanilid till protein provet är dock inte lämplig. AtHIRD11 visar bred topp mönster, och att lägga till EOF markören till provet skulle dölja två toppar. Därför används markören i en separat körning. Innan bindande beteende undersöks, bekräftas det att topparna hittade under tidigare experiment är från olika konformationer. Således CGE används för att skilja mellan de protein konformationer, den posttranslationella modifierat protein och orenheter, som fragment av AtHIRD11, av deras olika massa. Därefter utreds kännetecknas AtHIRD11 provets bindande beteende mot olika olika metalljoner.
Syftet med denna artikel är att beskriva ett experiment att skilja mellan en IDP och andra komponenter i ett prov för att utvärdera skillnader i bindande beteendet hos olika konformationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
För alla CE experiment är utarbetandet av kapillären ett kritiskt steg. Eftersom det är ett glasrör med en liten diameter, kan det lätt bryta på platser där beläggningen avlägsnas när det sköts. Installationen av kapillären i instrumentet bör göras mycket noggrant.
De kritiska steg som ingår i Ess metoden främst avser den experimentella setup. Ett annat viktigt steg är att hitta rätt prov injektion parametrarna. Den injicerade mängden provet måste vara tillräckligt för h…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar tackar Masakuza Hara (Research Institute of Green Science och Technology, universitet i Shizuoka, Japan) för att tillhandahålla AtHIRD11 protein proverna.
Materials
| AtHIRD11 sample | Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) | – | Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli |
| Barefused silica capillary | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | comercially not available anymore | Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G7100A | Capillary electrophoresis instrument |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | Syringe for filtration |
| Rotilabo-syringe filters | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | KY62.1 | PVDF membrane filter for solution filtration |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.023 | Micro pipette for sample handling |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.120 | Micro pipette for handling the ligand solutions |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 08 | Preparing theNaOH solution |
| Bulb pipette 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 14 | Preparing the ligand solution |
| Duran glas volumetric flask 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1457 | Preparing the ligand stock solution |
| Duran glas volumetric flask 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1054 | Preparing the ligand stock solution |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | comercially not available anymore | Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 397229-5G | Electroosmotic flow marker |
| Manganese(II) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 13217 | Ligand |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 431788-100G | Rinsing ingredient |
| Bariumchloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 202738-5G | Ligand |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 71729-100G | Solublizing protein for capillary gel electrophoresis |
| Nickel(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 654507-5G | Ligand |
| Selenium(IV) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 323527-10G | Ligand |
| 2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 252859-100G | Buffer ingredient |
| Zinc(II) chloride | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1088160250 | Ligand |
| Strontium nitrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1078720250 | Ligand |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1371015000 | Ligand |
| 37% hydrochloric acid | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1003171000 | Adjusting pH |
| Copper(II) chloride dihydrate | Riedel-de Haën (Seelze, Germany) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germany) | 10000084;0 | Ultrasonic bath |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G2070-91126 | Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it |
References
- Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
- Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
- Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
- Nachbar, M., et al. Metal ion – dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
- Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
- Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
- Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
- Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
- Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
- Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
- Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
- Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).
