제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출
Summary
여기, 우리가 근접 결 찰 분석 결과 (PLA)를 사용 하 여 높은 감도와 고정된 셀에 MST1/MST2 heterodimerization를 시각화 하는 방법을 보여 줍니다.
Abstract
레 귤 레이트 된 단백질-단백질 상호 작용은 많은 신호 이벤트, 지도 원리 이며 이러한 이벤트의 검출 같은 경로 구성 하는 방법을 그들이 작동 하는 방식 이해는 중요 한 요소. 셀, 단백질 단백질 상호 작용을 검출 하는 많은 방법이 있다 그러나 상대적으로 몇 가지를 사용할 수 있는 내 생 단백질 사이 상호 작용을 검출. 그러한 한 방법, 근접 결 찰 분석 결과 (PLA), 그것의 사용을 추천 하 몇 가지 장점이 있습니다. 단백질 단백질 상호 작용 분석의 다른 일반적인 방법에 비해, PLA는 상대적으로 높은 감도 특이성, 최소 셀 조작, 그리고, 여기에 설명 된 프로토콜에서 수행할 수 있습니다, 그리고 특정 대상만 두 필요 다른 종에서 파생 된 항 체 (예., 마우스와 토끼에서)와 1 개의 특수 시 약: covalently 특정 연결 된 oligonucleotides는 이차 항 체의 집합, 서로 가까이에 때, 만들는 제자리에서 PCR 또는 압 연 원형 증폭에 대 한 amplifiable 플랫폼. 이 프레 젠 테이이 션에서 우리 고정된 셀에 MST1 및 MST2에에서 변화를 시각화 하기 위해 PLA 기법을 적용 하는 방법을 보여 줍니다. 이 원고에 설명 된 기술은 세포 신호 전달 연구의 분석에 특히 적용 됩니다.
Introduction
MST1/Hippo 신호 장애 발달 장애 및 발암1에 연결 되었습니다. 포유류에서 MST1 및 MST2 kinases 활성화 (phosphorylate) MOB1 및 LATS1/2, 후자는 phosphorylates 그리고 transcriptional 공동 활성 제 예 관련 단백질 (YAP)2생긴다. 활성 (unphosphorylated) 형태로 얍에 종양 활동, 세포 증식 유전자;의 녹음을 향상 반대로, 야프 뚱 땡 통로 의해 비활성화 됩니다, 세포 증식을 억제 하 고 apoptosis 승진3. 조직, MST1 및 MST2 활성 homodimers, 주로 존재 하지만 종양 자극 MST1/MST2 heterodimers의 수준을 높일 수 있으며 같은 heterodimers 비활성4. 그러나, MST1/MST2 heterodimerization 규제 어떻게 제대로 이해 남아 있다. 호모-및 heterodimers MST1의 C-터미널 코일 코일 지역 및 MST2 사라 도메인5로 알려진 사이의 상호 작용 중재 를 통해 있습니다. 사용 하는 제자리에서 PLA 시연이 문서에서 우리는 인간의 Schwann 세포 (HSC)와 인간 미 발달 신장 세포 (HEK 293)에 MST1/MST2 heterodimers의 존재를 표시. PLA 생 단백질-단백질 상호 작용, 식별 하 고 transgene 식의 필요 또는 피토 프 태그의 사용 없이 측정할 수 있는 감지를 허용 하기 때문에 다른 단백질/단백질 상호 작용 검출 방법에 비해 이점이 있다 6.
신호 변환 통로 크게 구성 단백질의 조건부 협회에 의해 제어 됩니다. 예를 들어 대부분 수용 체 티로신 kinases의 자극 양식 추가 단지 그들의 호모 이합체 또는 이종 화 및 후속 연관 추가 세포내 신호 전달 단백질를 스스로 리드. PLA 방법의 목적은 셀, 단백질 사이 근접 시각화 하 단백질 보다 30-40 nm 간격에 제공. 단백질 근접 일반적으로 첫 번째 종에 발생 하는 적절 한 기본 항 체와 세포 잠복기에 의해 검출 된다 (예., 토끼와 마우스) 각 상호 작용 단백질에 대 한 추가 종의 2 차 항 체, 전 짧은 결합 된 DNA 프로브합니다. DNA 프로브 가까운 위치에, 모두 제자리에서 PCR에 의해 또는 원 메커니즘을 압 연 하 여 확대를 위한 플랫폼을 형성 하는 이러한 프로브는 특정 연결 DNA oligonucleotide 동시에 바인딩할 수 있습니다. 증폭 반응에 추가 하는 형광 태그 허용 쉽게 계량 하 고 셀7,8, 에서 특정 영역에 지역화 된 수 있는 형광 점으로 표시 되는 상호 작용 단백질의 시각화 9 , 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 그것은 매우 편리 하 게 여러 (14-16) 셀 라인 실험을 수행 하 고 현미경 분석 하는 동안 모든 시간 샘플을 변경할 필요가 없습니다이 실험을 위해 유리 챔버 슬라이드를 사용 하 여 유용한 발견. 항 체와 교차 오염에 대 한 위험 증가 등, 몇 가지 합병증이 발생할 수 있습니다. 따라서, 우리는 것이 좋습니다 모든 잘 세척 실험의 증가 기간에도 불구 하 고 Coplin jar를 사용 하 여 대신 개별적으로…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 최적화 및 특정 마리아 Radu 갈리 나 Semenova에서이 프로토콜의 검증에 기여에 대 한 전체 Chernoff 연구소 감사. 우리는 또한 세포 이미징 시설 폭스 체이스 암 센터의 안드레이 Efimov 감사합니다. 이 작품은 JC (R01 CA148805) NIH에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
