Formation de Biofilm oral sur différents matériaux pour Implants dentaires
Summary
Nous présentons ici un protocole afin d’évaluer la formation de biofilm oral sur des matériaux titane et la zircone pour les culées de prothèses dentaires, y compris l’analyse de la viabilité de cellules bactériennes et des caractéristiques morphologiques. Un modèle in situ , associé à des techniques de microscopie puissant est utilisé pour l’analyse de biofilm oral.
Abstract
Implants dentaires et leurs composants prothétiques sont sujettes à une colonisation bactérienne et la formation de biofilm. L’utilisation de matériaux qui fournit la faible adhérence microbienne peut réduire la prévalence et la progression de maladies péri-implantaires. Compte tenu de l’environnement buccal complexité et oral biofilm hétérogénéité, microscopie techniques sont nécessaires et qui peut permettre une analyse de biofilm de la surface des dents et des matériaux dentaires. Cet article décrit une série de protocoles mis en œuvre pour comparer la formation de biofilm oral sur titane et matériaux céramiques pour des piliers prothétiques, ainsi que les méthodes impliquées dans les analyses de biofilms par voie orale aux niveaux cellulaires et morphologiques. Le modèle in situ pour évaluer la formation de biofilm oral sur des matériaux titane et la zircone pour les culées de prothèses dentaires, tel que décrit dans la présente étude fournit une préservation satisfaisante du biofilm 48 h, démontrant ainsi la pertinence méthodologique. La microscopie multiphoton permet l’analyse d’un représentant de la région du biofilm formé sur le matériel de test. En outre, l’utilisation de fluorophores et le traitement des images à l’aide de la microscopie multiphoton permet l’analyse de la viabilité bactérienne dans une population très hétérogène des micro-organismes. La préparation de spécimens biologiques pour la microscopie électronique encourage la protection structurelle du biofilm, des images avec une bonne résolution et sans artefacts.
Introduction
Biofilms bactériens sont complexes, fonctionnellement et structurellement organisée des communautés microbiennes, caractérisé par une diversité d’espèces microbiennes qui synthétisent un polymère extracellulaire, biologiquement active matrix1,2. L’adhérence bactérienne des surfaces biotiques ou abiotiques est précédée d’une formation de la pellicule acquise, principalement constituée de glycoprotéines salivaires1,3,4. Faibles interactions physico-chimiques entre les micro-organismes et la pellicule sont initialement mis en place et suivies par des rapports plus étroits entre les adhésines bactériennes et les récepteurs de la glycoprotéine de la pellicule acquise. La diversité microbienne augmente progressivement par le biais de la coagrégation des colonisateurs secondaires aux récepteurs des bactéries déjà attachés, formant une communauté multi-espèces1,3,4, 5.
L’homéostasie de la microflore orale et sa relation symbiotique avec l’hôte est important dans le maintien de la santé buccodentaire. La dysbiose au sein de biofilms orale peut accroître le risque pour le développement de la carie et la maladie parodontale2,5. Les études cliniques démontrent une relation de cause à effet entre l’accumulation du biofilm sur les dents ou implants dentaires et l’apparition de gingivite ou péri-implantaire mucosite6,7. La progression du processus inflammatoire entraîne péri-implantites et la perte conséquente de l’ implant8.
Implants dentaires et leurs composants prothétiques sont sujettes à une colonisation bactérienne et la formation de biofilm9. L’utilisation de matériaux avec une composition chimique et la topographie de la surface qui offre une adhérence microbienne faible peut réduire la prévalence et la progression du péri-implantaire maladies9,10. Titane est le matériau le plus utilisé pour la fabrication des piliers prothétiques pour les implants ; Cependant, les matériaux céramiques ont été nouvellement introduites et gagnent en popularité comme alternative au titane en raison de leurs propriétés esthétiques et biocompatibilité11,12. Également important, les matériaux céramiques ont été associés à censé réduire les risques d’adhérer aux microorganismes, principalement en raison de leur rugosité, mouillabilité et énergie libre de surface10,13.
Des études in vitro ont contribué à des avancées significatives dans la compréhension de l’adhérence microbienne au pilier prothétique surfaces9,14,15,16,17. Cependant, l’environnement dynamique de la cavité buccale, caractérisée par ses variables de température et de pH et de la disponibilité des nutriments, ainsi que par la présence de forces de cisaillement, n’est pas reproductible dans in vitro des protocoles expérimentaux18, 19. Pour contourner ce problème, une alternative est l’utilisation de modèles de in situ de la formation de biofilm, qui avantageusement conserve sa structure tridimensionnelle pour ex vivo analyse10,20, 21 , 22 , 23 , 24.
L’analyse de la structure complexe du biofilm formé sur des substrats par voie orale nécessite l’utilisation des techniques de microscopie capables d’afficher la matière optiquement dense25. Laser multiphotonique, microscopie à balayage est une option moderne pour l’analyse structurale de biofilm26. Elle est caractérisée par l’utilisation de l’optique non linéaire avec une source d’éclairage proche de la longueur d’onde infrarouge, pulsé à femtosecondes27. Cette méthode est indiquée pour l’acquisition d’images de matières marquées par des fluorophores, en plus des images générées par signaux optiques non linéaires, dérivés d’un phénomène appelé la deuxième génération harmonique ou autofluorescence. Parmi les avantages de la microscopie multiphoton sont la profondeur de la grande image obtenue avec la cellule minimum dommages causés par l’intensité de la lumière d’excitation27.
Pour une analyse de la viabilité du biofilm sur les surfaces abiotiques par microscopie multiphoton, l’utilisation de l’acide nucléique fluorescent colorants présentant des caractéristiques spectrales différentes et une capacité de pénétration dans les cellules bactériennes est requis28. Fluorophores SYTO9 (vert fluorescent) et l’iodure de propidium (rouge-fluorescent) peuvent être utilisés pour une différenciation visuelle entre les bactéries vivantes et mortes28,29,30. L’iodure de propidium pénètre seuls bactéries avec membranes endommagées, tandis que SYTO9 pénètre dans les cellules bactériennes avec une membrane intacte et compromise. Lorsque les deux colorants sont présentes à l’intérieur d’une cellule, l’iodure de propidium a une plus grande affinité pour les acides nucléiques et déplace SYTO9, marquant rouge28,30.
Compte tenu de l’environnement buccal complexité et oral biofilm hétérogénéité, microscopie techniques sont nécessaires et qui peut permettre l’analyse de biofilm de la surface des dents et des matériaux dentaires. Cet article décrit une série de protocoles mis en œuvre pour comparer la formation de biofilm oral sur titane et matériaux céramiques pour des piliers prothétiques, ainsi que les méthodes impliquées dans les analyses de biofilms par voie orale aux niveaux cellulaires et morphologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit dans la présente étude visait à évaluer la formation de biofilm sur les matériaux titane et la zircone pour piliers prothétiques, y compris l’analyse de la viabilité des cellules bactériennes et des caractéristiques morphologiques. Pour ce faire, un modèle in situ de la formation de biofilm a été conçu, composé d’un appareil intra-oral capable d’accueillir des échantillons du matériel test et gardez-les à l’exposé à l’environnement dynamique par voie orale pendan…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier José Augusto Maulin du laboratoire de microscopie multi-utilisateurs (école de médecine de Ribeirão Preto) pour son aide généreuse avec l’EDS et SEM analyses et Hermano Teixeira Machado pour son assistance technique généreuse dans l’édition vidéo.
Materials
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors – X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
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