Mündliche Biofilmbildung auf unterschiedlichen Materialien für Zahnimplantate
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur mündlichen Biofilmbildung auf Titan und Zirkonoxid Materialien für Zahnersatz Aufbauten, einschließlich der Analyse von Bakterienzellen Lebensfähigkeit und morphologische Eigenschaften zu bewerten. Der oralen Biofilm-Analyse dient eine in Situ -Modell mit mächtigen mikroskopiertechniken verbunden.
Abstract
Implantate und prothetischen Komponenten sind anfällig für bakterielle Kolonisation und Biofilmbildung. Die Verwendung von Materialien, die geringe mikrobielle Haftung bietet kann die Prävalenz und Fortschreiten der periimplantären Erkrankungen reduzieren. Angesichts der Mundmilieu Komplexität und oralen Biofilm Heterogenität, Mikroskopie, die Techniken benötigt werden, die eine Biofilm-Analyse der Oberflächen der Zähne und Dentalmaterialien aktivieren können. Dieser Artikel beschreibt eine Reihe von Protokollen für den Vergleich von mündlichen Biofilmbildung auf Titan und keramische Werkstoffe für prothetische Aufbauten sowie die Modalität in oralen Biofilmen Analysen auf morphologische und zellulärer Ebene umgesetzt. Das Modell in Situ , mündliche Biofilmbildung auf Titan und Zirkonoxid Materialien für Zahnersatz Widerlager zu bewerten, wie beschrieben in dieser Studie bietet eine befriedigende Erhaltung des Biofilms 48 h, so bekunden, methodische Angemessenheit. Multiphoton-Mikroskopie ermöglicht die Analyse eines Vertreters der Bereich des Biofilms auf der Testmaterialien gebildet. Darüber hinaus ermöglicht den Einsatz des Fluorophore und die Verarbeitung der Bilder multiphoton Mikroskopie mit die Analyse der bakteriellen Lebensfähigkeit in einer sehr heterogenen Bevölkerung von Mikroorganismen. Die Vorbereitung der biologischen Proben für Elektronenmikroskopie fördert die bauliche Erhaltung der Biofilm, Bilder mit guter Auflösung und keine Artefakte.
Introduction
Bakterielle Biofilme sind komplex, funktionell und strukturell organisiert mikrobielle Gemeinschaften, gekennzeichnet durch eine Vielfalt an mikrobielle Spezies, die eine extrazelluläre, biologisch aktiven Polymer-Matrix1,2zu synthetisieren. Die bakterielle Adhäsion zu biotischen und abiotischen Oberflächen ist eine Formation von der erworbenen Häutchen, hauptsächlich bestehend aus Speichel Glykoproteine1,3,4vorangestellt. Schwache physikalisch-chemischen Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen und das Häutchen sind zunächst etabliert und gefolgt durch stärkere Wechselbeziehungen zwischen bakteriellen Adhesins und Glykoprotein-Rezeptoren von der erworbenen Häutchen. Mikrobielle Vielfalt allmählich durch die Coaggregation der sekundären Kolonisatoren an die Rezeptoren der bereits angeschlossenen Bakterien bilden eine gemischte Gemeinschaft1,3,4, 5.
Homöostase der mündlichen Mikrobiota und seine symbiotische Beziehung mit dem Host ist wichtig für die Erhaltung der Mundgesundheit. Die Dysbiose in oralen Biofilmen erhöht das Risiko für die Entwicklung von Karies und Parodontitis2,5. Klinische Studien zeigen eine Ursache-Wirkungs-Beziehung zwischen der Akkumulation von Biofilm auf den Zähnen oder Zahnimplantaten und die Entwicklung von Gingivitis oder periimplantären Mukositis6,7. Das Fortschreiten des entzündlichen Prozesses führt zu Periimplantitis und dem damit verbundenen Verlust der Implantat-8.
Implantate und prothetischen Komponenten sind anfällig für bakterielle Besiedlung und Biofilm-Bildung-9. Die Verwendung von Materialien mit einer chemischen Zusammensetzung und der Oberflächentopographie, die geringe mikrobielle Haftung bietet möglicherweise die Prävalenz und Fortschreiten der periimplantären Erkrankungen9,10reduzieren. Titan ist das am häufigsten verwendete Material für die Herstellung der prothetische Aufbauten für Implantate; jedoch keramische Werkstoffe wurden vor kurzem eingeführt und werden immer beliebter als Alternative zu Titan wegen ihrer ästhetischen Eigenschaften und Biokompatibilität11,12. Auch wichtig ist, wurden keramische Werkstoffe mit einem angeblich weniger Potenzial zur Einhaltung von Mikroorganismen, vor allem aufgrund ihrer Rauheit der Oberfläche, Benetzbarkeit und freien Oberflächenenergie10,13verbunden.
In-vitro- Studien haben bedeutende Fortschritte im Verständnis der mikrobiellen Adhäsion auf prothetische Abutment Oberflächen9,14,15,16,17beigetragen. Das dynamische Umfeld der Mundhöhle, zeichnet sich durch seine unterschiedlichen Temperatur und pH-Wert und nährstoffverfügbarkeit sowie durch die Anwesenheit von Scherkräften, ist jedoch nicht reproduzierbar in in-vitro- experimentelle Protokolle18, 19. Um dieses Problem zu überwinden, ist eine Alternative die Verwendung von in Situ -Modellen der Biofilmbildung, die vorteilhafterweise seine dreidimensionale Struktur für ex-Vivo Analyse10,20, bewahrt 21 , 22 , 23 , 24.
Die Analyse der komplexen Struktur des Biofilms auf mündliche Substraten gebildet erfordert den Einsatz von mikroskopiertechniken optisch dichter Materie25anzeigen kann. Multiphoton Laser-scanning-Mikroskopie ist eine moderne Option für Biofilm Strukturanalyse26. Es zeichnet sich durch die Verwendung der nichtlinearen Optik mit einer Lichtquelle in der Nähe der Infrarot-Wellenlänge, gepulst bis Femtosekunden27. Diese Methode ist für die Bildaufnahme der Autofluoreszenz Materialien oder Materialien geprägt von Fluorophore, neben Bildern erzeugt durch nichtlineare optische Signale, die ein Phänomen bekannt als zweite harmonische Generation abgeleitet angegeben. Zu den Vorteilen der multiphoton Mikroskopie ist die große Bildtiefe mit minimalen Zellschäden verursacht durch die Intensität der Anregung Licht27erhalten.
Für eine Rentabilität Analyse des Biofilms auf abiotischen Oberflächen durch multiphoton Mikroskopie die Verwendung von fluoreszierenden Nukleinsäure Farbstoffe mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften und eine Eindringen Kapazität in Bakterienzellen erforderlichen28. Fluorophores SYTO9 (grün-fluoreszierende) und Propidium Jodid (rot-fluoreszierend) können für eine visuelle Unterscheidung zwischen lebenden und toten Bakterien28,29,30verwendet werden. Propidium Jodid dringt nur Bakterien mit beschädigten Membranen, während SYTO9 Bakterienzellen mit einer intakten und kompromittiert Membran tritt. Wenn beide Farbstoffe innerhalb einer Zelle vorhanden sind, hat eine größere Affinität für Nukleinsäuren Propidium Jodid und verdrängt SYTO9, kennzeichnet es rot28,30.
Angesichts der Mundmilieu Komplexität und oralen Biofilm Heterogenität, Mikroskopie, die Techniken benötigt werden, die die Biofilm-Analyse der Oberflächen der Zähne und Dentalmaterialien aktivieren können. Dieser Artikel beschreibt eine Reihe von Protokollen für den Vergleich von mündlichen Biofilmbildung auf Titan und keramische Werkstoffe für prothetische Aufbauten sowie die Modalität in oralen Biofilmen Analysen auf morphologische und zellulärer Ebene umgesetzt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um die Biofilmbildung auf Titan und Zirkonoxid Materialien für prothetische Aufbauten, einschließlich der Analyse der Bakterienzelle Lebensfähigkeit und morphologische Eigenschaften zu bewerten. Um dies zu erreichen, wurde eine in Situ -Modell der Biofilmbildung entwickelt, bestehend aus einer intraoralen Geräts in der Lage, Proben von der Testmaterialien unterzubringen und halten sie die dynamische Mundmilieu für 48 h ausgesetzt. Das Gerät wurde al…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken José Augusto Maulin Mikroskopie Multiuser Laboratory (School of Medicine der Ribeirão Preto), für seine großzügige Unterstützung bei der EDS und SEM Analysen und Hermano Teixeira Machado für seine großzügige technische Hilfe bei der video-Ausgabe.
Materials
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors – X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
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