Muntlig Biofilm formasjon på ulike materialer for tannimplantater
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å evaluere muntlig biofilm formasjon på Titan og zirconia materialer for dental protese distanser, inkludert analyse av bakterieceller levedyktighet og morfologiske kjennetegn. En i situ modell forbundet med kraftig mikroskopi teknikker brukes for muntlig biofilm analyse.
Abstract
Dental implantater og deres protese komponenter er liggende å bakteriell kolonisering og biofilm formasjon. Bruk av materialer som gir lav mikrobiell vedheft kan redusere utbredelsen og progresjon av peri-implantat sykdommer. I lys av den muntlig miljø kompleksitet og muntlig biofilm heterogeniteten, mikroskopi teknikker er nødvendig som kan aktivere en biofilm analyse av overflater av tenner og fordypning materialer. Denne artikkelen beskriver en rekke protokoller implementert for å sammenligne muntlig biofilm formasjon på Titan og keramiske materialer for protese distanser, i tillegg til metodene involvert i muntlig biofilm analyser på morfologiske og mobilnettet nivå. I situ modellen evaluere muntlig biofilm formasjon på Titan og zirconia materialer for dental protese distanser som beskrevet i denne studien gir en tilfredsstillende bevaring av 48t biofilm, og dermed demonstrere metodologiske tilstrekkelighet. Multiphoton mikroskopi tillater analyse av en området representant for biofilm dannet test materialet. I tillegg tillater bruk av fluorophores og behandling av bildene benytter multiphoton mikroskopi analyse av bakteriell levedyktigheten i en svært heterogen befolkning av mikroorganismer. Utarbeidelse av biologiske prøver for elektronmikroskop fremmer strukturelle bevaring av biofilm, bilder med god oppløsning og noen gjenstander.
Introduction
Bakteriell biofilm er komplekse, funksjonelt og strukturelt organisert mikrobielle samfunn preget av et mangfold av mikrobielle arter som synthesizer en ekstracellulære, biologisk aktive polymer matrise1,2. Bakteriell vedheft biotiske eller abiotiske overflater er foran en formasjon av ervervet pellicle, hovedsakelig bestående av salivary glykoproteiner1,3,4. Svak mekanisk-interaksjoner mellom mikroorganismer og pellicle er først etablert og etterfulgt av sterkere interaksjoner mellom bakteriell adhesins og glykoprotein reseptorer av ervervet pellicle. Mikrobiell mangfold øker gradvis gjennom coaggregation av sekundære kolonistene på reseptorene av allerede vedlagt bakterier, danner en multispecies samfunnet1,3,4, 5.
Homeostase av den muntlige bakterieflora og dens symbiotisk forhold til verten er viktig å opprettholde munnhygiene. Dysbiosis i muntlig biofilm kan øke risikoen for utvikling av karies og periodontal sykdom2,5. Kliniske studier viser en årsak og virkning forholdet mellom akkumulering av biofilm på tenner eller tannimplantater og utvikling av Gingivitt eller peri-implantat mukositt6,7. Utviklingen av inflammatoriske prosessen fører til peri-implantitis og påfølgende tap av implantatet8.
Dental implantater og deres protese komponenter er liggende å bakteriell kolonisering og biofilm formasjon9. Bruk av materialer med kjemiske sammensetning og form som gir lav mikrobiell vedheft kan redusere utbredelsen og progresjon av peri-implantat sykdommer9,10. Titan er den mest brukte materialet for produksjon av protese distanser for implantater; imidlertid keramiske materialer ble nylig introdusert og er stadig mer populært som et alternativ til Titan på grunn av deres estetiske egenskaper og biocompatibility11,12. Også viktigere, har keramiske materialer vært forbundet med en angivelig reduserte potensiell overholder mikroorganismer, hovedsakelig på grunn av deres overflateruhet, wettability og overflate fri energi10,13.
In vitro studier har bidratt til betydelige fremskritt i forståelsen av mikrobielle vedheft til protese distansen overflater9,14,15,16,17. Dynamisk miljøet i munnhulen, preget av sin varierende temperatur og pH og næringsstoffer tilgjengelighet samt tilstedeværelsen av skjær krefter, er imidlertid ikke reproduserbare i vitro eksperimentelle protokoller18, 19. Du løser dette problemet, er et alternativ bruk av i situ modeller av biofilm formasjon, som bevarer advantageously tredimensjonale strukturen for ex vivo analyse10,20, 21 , 22 , 23 , 24.
Analyse av komplekse strukturen i biofilm dannet på muntlig underlag krever bruk av mikroskopi teknikker kan vise optisk tett saken25. Multiphoton laserskanning mikroskopi er et moderne alternativ for biofilm strukturelle analysen26. Det er preget av bruk av ikke-lineær optikk med en belysning kilde nær infrarød bølgelengde, pulserende til femtoseconds27. Denne metoden er indisert for bilde oppkjøpet av autofluorescence eller materialer preget av fluorophores, i tillegg til bilder generert av ikke-lineær optisk signaler fra et fenomen kjent som andre harmonisk generasjon. Blant fordelene multiphoton mikroskopi er flott bilde dybden med minimum celle skade forårsaket av intensiteten av eksitasjon lys27.
For en levedyktighet analyse av biofilm på abiotiske overflater av multiphoton mikroskopi, bruk av fluorescerende nukleinsyre fargestoffer med forskjellige spektrale egenskapene og gjennomtrenging kapasitet i bakterielle celler er nødvendig28. Fluorophores SYTO9 (grønn-fluorescerende) og propidium iodide (rød-fluorescerende) kan brukes til å visuelt skille mellom levende og døde bakterier28,29,30. Propidium iodide trenger bare bakterier med skadet membraner, mens SYTO9 inn bakterielle celler med en intakt og kompromittert membran. Når begge fargestoffer finnes inne i en celle, propidium iodide har en større affinitet for nucleic syrer og fortrenger SYTO9, markerer den røde28,30.
I lys av den muntlig miljø kompleksitet og muntlig biofilm heterogeniteten, mikroskopi teknikker er nødvendig som kan aktivere biofilm analyse av overflater av tenner og fordypning materialer. Denne artikkelen beskriver en rekke protokoller implementert for å sammenligne muntlig biofilm formasjon på Titan og keramiske materialer for protese distanser, i tillegg til metodene involvert i muntlig biofilm analyser på morfologiske og mobilnettet nivå.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet i denne studien ble utviklet for å evaluere biofilm dannelsen på Titan og zirconia materialer i protese distanser, inkludert analyse av bakteriell celle levedyktighet og morfologiske kjennetegn. For å oppnå dette, ble en i situ modell av biofilm formasjon designet, som består av en intraoral enheten i stand til å imøtekomme prøver av testen materiale og holde dem utsatt for dynamisk muntlig miljø for 48 timer. Enheten ble ansett som behagelig og sette inn, fjerne og feilfri av friv…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker José Augusto Maulin fra mikroskopi flerbruker Laboratory (School of Medicine i Ribeirão Preto) for hans hjelp med EDS og SEM analyser og Hermano Teixeira Machado for sin generøse kundestøtte i video-utgaven.
Materials
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors – X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
References
- Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
- Samaranayake, L., Matsubara, V. H. Normal Oral Flora and the Oral Ecosystem. Dental Clinics of North America. 61 (2), 199-215 (2017).
- Larsen, T., Fiehn, N. E. Dental biofilm infections – an update. Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 125 (4), 376-384 (2017).
- Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontology 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
- Marsh, P. D., Zaura, E. Dental biofilm: ecological interactions in health and disease. Journal of Clinical Periodontology. 44 Suppl 18, S12-S22 (2017).
- Zitzmann, N. U., Berglundh, T., Marinello, C. P., Lindhe, J. Experimental peri-implant mucositis in man. Journal of Clinical Periodontology. 28 (6), 517-523 (2001).
- Meyer, S., et al. Experimental mucositis and experimental gingivitis in persons aged 70 or over. Clinical and biological responses. Clinical Oral Implants Research. 28 (8), 1005-1012 (2017).
- Salvi, G. E., Cosgarea, R., Sculean, A. Prevalence and Mechanisms of Peri-implant Diseases. Journal of Dental Research. 96 (1), 31-37 (2017).
- Hahnel, S., Wieser, A., Lang, R., Rosentritt, M. Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials. Clinical Oral Implants Research. 26 (11), 1297-1301 (2015).
- Nascimento, C., et al. Bacterial adhesion on the titanium and zirconia abutment surfaces. Clinical Oral Implants Research. 25 (3), 337-343 (2014).
- Nakamura, K., Kanno, T., Milleding, P., Ortengren, U. Zirconia as a dental implant abutment material: a systematic review. The International Journal of Prosthodontics. 23 (4), 299-309 (2010).
- Scarano, A., Piattelli, M., Caputi, S., Favero, G. A., Piattelli, A. Bacterial adhesion on commercially pure titanium and zirconium oxide disks: an in vivo human study. Journal of Periodontology. 75 (2), 292-296 (2004).
- Nascimento, C., et al. Microbiome of titanium and zirconia dental implants abutments. Dental Materials. 32 (1), 93-101 (2016).
- Rimondini, L., Cerroni, L., Carrassi, A., Torricelli, P. Bacterial colonization of zirconia ceramic surfaces: an in vitro and in vivo study. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 17 (6), 793-798 (2002).
- de Avila, E. D., Avila-Campos, M. J., Vergani, C. E., Spolidorio, D. M., Mollo Fde, A. Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces. Journal of Prosthetic Dentistry. 115 (4), 428-436 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Impact of Physical Chemical Characteristics of Abutment Implant Surfaces on Bacteria Adhesion. Journal of Oral Implantology. 42 (2), 153-158 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Effect of titanium and zirconia dental implant abutments on a cultivable polymicrobial saliva community. Journal of Prosthetic Dentistry. 118 (4), 481-487 (2017).
- Lin, N. J. Biofilm over teeth and restorations: What do we need to know?. Dental Materials. 33 (6), 667-680 (2017).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Tomas, I. The intraoral device of overlaid disk-holding splints as a new in situ oral biofilm model. Journal of Clinical and Experimental Dentistry. 7 (1), e126-e132 (2015).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Vilaboa, C., Suarez-Quintanilla, D., Tomas, I. Devices for in situ Development of Non-disturbed Oral Biofilm. A Systematic Review. Frontiers in Microbiology. 7, 1055 (2016).
- Burgers, R., et al. In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces. Clinical Oral Implants Research. 21 (2), 156-164 (2010).
- do Nascimento, C., et al. Oral biofilm formation on the titanium and zirconia substrates. Microscopy Research and Technique. 76 (2), 126-132 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. In vivo study of the initial bacterial adhesion on different implant materials. Archives of Oral Biology. 58 (9), 1139-1147 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. Bacterial adhesion and biofilm formation on yttria-stabilized, tetragonal zirconia and titanium oral implant materials with low surface roughness – an in situ study. Journal of Medical Microbiology. 65 (7), 596-604 (2016).
- Thomsen, H., et al. Delivery of cyclodextrin polymers to bacterial biofilms – An exploratory study using rhodamine labelled cyclodextrins and multiphoton microscopy. International Journal of Pharmaceutics. 531 (2), 650-657 (2017).
- Lakins, M. A., Marrison, J. L., O’Toole, P. J., van der Woude, M. W. Exploiting advances in imaging technology to study biofilms by applying multiphoton laser scanning microscopy as an imaging and manipulation tool. Journal of Microscopy. 235 (2), 128-137 (2009).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A. 61 (2), 189-195 (2004).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Placko, H. E., Mishra, S., Weimer, J. J., Lucas, L. C. Surface characterization of titanium-based implant materials. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 15 (3), 355-363 (2000).
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two-photon excitation fluorescence microscopy. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 399-429 (2000).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. , 11-24 (2013).
- Gardi, J. E., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. The proportionator: unbiased stereological estimation using biased automatic image analysis and non-uniform probability proportional to size sampling. Computers in Biology and Medicine. 38 (3), 313-328 (2008).
- Melvin, N. R., Poda, D., Sutherland, R. J. A simple and efficient alternative to implementing systematic random sampling in stereological designs without a motorized microscope stage. Journal of Microscopy. 228 (Pt 1), 103-106 (2007).
- Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 68 (2), 901-909 (2002).
- Neu, T. R., Woelfl, S., Lawrence, J. R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation). Journal of Microbiological Methods. 56 (2), 161-172 (2004).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23 (4), 233-242 (2015).
- Lacroix-Gueu, P., Briandet, R., Leveque-Fort, S., Bellon-Fontaine, M. N., Fontaine-Aupart, M. P. In situ measurements of viral particles diffusion inside mucoid biofilms. Comptes Rendus Biologies. 328 (12), 1065-1072 (2005).
- Briandet, R., et al. Fluorescence correlation spectroscopy to study diffusion and reaction of bacteriophages inside biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 74 (7), 2135-2143 (2008).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. International Endodontic Journal. 38 (11), 775-788 (2005).
- Hannig, C., Follo, M., Hellwig, E., Al-Ahmad, A. Visualization of adherent micro-organisms using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 59 (Pt 1), 1-7 (2010).
- Knutton, S. Electron microscopical methods in adhesion. Methods in Enzymology. 253, 145-158 (1995).
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
