Summary

Визуализация микробиоты в кишки клеща в целом гора в Situ гибридизация

Published: June 01, 2018
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол пространственно и височно оценить наличие жизнеспособных микрофлору в тик кишки с использованием подхода изменение состава Гора в гибридизации situ.

Abstract

Инфекционных заболеваний, передаваемых членистоногих векторами по-прежнему представляют собой значительную угрозу для здоровья людей во всем мире. Патогенных микроорганизмов, вызывающих эти заболевания, не существует в изоляции, когда они колонизировали вектор; скорее они скорее всего заниматься взаимодействия с резидентом микроорганизмов в просвете кишки. Микробиота вектор была продемонстрирована возможность играть важную роль в передаче возбудителя для нескольких трансмиссивных заболеваний. Ли-резидентов бактерий в кишечнике Черноногий клещ, вектор ряд патогенов человека, включая Borrelia burgdorferi, влияние клеща передачи возбудителей не определяется. Мы требуем методы для характеризующие состав бактерий, связанные с тик кишки для содействия более глубокому пониманию потенциальных межвидовой взаимодействий в кишечнике клеща. Использование целом гора в situ гибридизация визуализировать стенограммы РНК, связанные с бактериальных вида позволяет для сбора качественных данных относительно численности и распределения микробиоты в неповрежденной ткани. Этот метод может использоваться для изучения изменений в обстановке микрофлору кишечника в течение клеща кормления и может также применяться для анализа экспрессии генов клеща. Окрашивание всей клеща кишок доходность информация о валовых пространственного распределения целевых РНК в ткани без необходимости для трехмерной реконструкции и менее пострадавших от загрязнения окружающей среды, который часто смешивает на основе виртуализации методы часто используются для изучения сложных микробных сообществ. В целом этот метод является ценным инструментом, который может использоваться для лучше понимать вектор возбудитель микробиоты взаимодействий и их роль в передачи болезни.

Introduction

Человека и животных патогенов, передано членистоногих векторов находятся во всем мире и приходится около 20% инфекционных заболеваний во всем мире1, но эффективный и не доступны безопасные вакцины против большинства этих патогенов. Наше понимание важной роли синантропных, симбиотических и патогенных микроорганизмов, известные как микрофлора2, модуляции и формирования здоровья почти всех размером3 расширяется. Теперь уже очевидно, что членистоногих векторами патогенов также гавани кишка микробиоты и эти связанные векторные микробиоты было показано влияние различных возбудителей трансмиссивных4,5. Членистоногих микрофлора состоит из эубактерии, археи, вирусов и эукариотических микробы как простейшие, нематод и грибов6. Однако, преобладающее исследований основное внимание уделялось эубактерии вследствие, в частности, наличия маркерных генов и справочные базы данных для выявления конкретных бактериальных членов.

С акцентом на Черноногий, тик вектор нескольких патогенов человека, включая Borrelia burgdorferi7, возбудителя болезни Лайма, оптимизации техники микробного визуализации была направлена на улучшение нашего понимания клеща кишка микробиоты в контексте взаимодействия вектор патогена. Несколько вопросов остаются ответа в поле микрофлора клеща. Кишечник является сайт первого расширенная встреча между клеща и входящие возбудителя в контексте горизонтально передаваемых патогенов; Таким образом понимание роли векторных кишка микробиоты в модуляции вектор возбудитель взаимодействия будет выявить значимые идеи. Клещи имеют уникальный режим переваривания крови еды, где обработка крови еды компонентов занимает место внутриклеточно8. В просвет кишки казалось бы служит судно содержать крови еды как тик каналы, и питательных веществ пищеварение и усваивание наступить на протяжении нескольких дней кормления и продолжить после пресыщения. Патогенов, приобретена галочку во время кормления войти в просвет кишки вместе с bloodmeal и таким образом просвет становится основной сайт взаимодействия среди клещей, возбудителя и резидентов микробиоты. Как пищеварение проходит через сытость и иксодовых клещей линьки, кишечнике претерпевает структурные и функциональные изменения9. Состав и пространственной организации gut бактерии также может меняться в концерте с меняющейся обстановке кишки. Таким образом, важно понять архитектуру резидентов бактерий в кишечнике клеща в полной мере понять взаимодействие клеща, возбудителя и микрофлору кишечника.

Молекулярные методы для описания связанного узла микробиоты регулярно используют высок объём параллельной последовательности стратегий10 усилить и последовательность бактериальной 16S рибосомной ДНК (рДНК). Эти стратегии виртуализации обойти необходимость получения стерильных культурах конкретных видов бактерий и предоставить подробное описание всех бактериальных членов, представленных в образце. Тем не менее такие стратегии являются осложняется неспособность различать экологических загрязнений от Бона ФИДЕ жителей. Кроме того при оценке образцов, таких как клещей, которые являются небольшими по размеру и следовательно содержат низкий микрофлору специфических ДНК урожайности, вероятность усиления экологических загрязнителей является увеличение11 и приводит к неоднозначной интерпретации микрофлора композиция. Таким образом, функциональные характеристики в сочетании с визуализацией конкретных жизнеспособных бактерий будет важно определить и различить микрофлора клеща височно и пространственно. К этой цели мы воспользовались целом гора РНК в situ гибридизация. Этот метод обычно используется для оценки картин выражения гена в органах и эмбрионы12,13,14 и позволяет полуколичественный анализ выражения над всей выборки интерес. Это отличается от традиционных в situ гибридизация методов, которые используют разделов ткани и часто требуют обширный анализ секционного материала с вычислительной Ассамблеей предсказать выражение в целом органов15. В то время как целое гора обычно относится к весь организмов12, здесь всего гора относится к весь кишки или органов. Преимущества использования РНК целом гора в situ гибридизация подход для оценки архитектуры клеща кишка микробиоты многократно. Тик кишки состоит из 7 пар дивертикулы, каждая пара разного размера16. Функциональные различия, если таковые имеются, среди этих дивертикулы, не поняли в контексте биологии тик, тик микробиоту или тик возбудитель взаимодействий. Манипуляции кишечника, которые разрыву кишки дивертикулы будет вытеснять микрофлору в просвете кишки или слабо связанные с кишки и привести к неправильному толкованию пространственной локализации микробиоты. Флуоресцировани обозначенного РНК в situ гибридизация ранее использовались для изучения клеща кишки стенограммы17 , фиксации и открыв индивидуальный кишку дивертикулы обеспечить зонд гибридизации и локализовать B. burgdorferi стенограммы путем разрезания парафин врезанных всего18, клещей. Оба эти подходы требуют манипуляций деления тканей до гибридизации, которые могут повлиять на архитектуру микрофлору кишечника.

В настоящем докладе мы подробно описать протокол для изучения жизнеспособных клеща кишка микробиоты с помощью целом гора в situ гибридизация (WMISH). Использование всего гора РНК в situ гибридизация позволяет глобального понимания присутствия и обилие конкретных кишки бактерий в различных регионах кишечник и может стимулировать новые идеи в биологии кишки клеща в контексте возбудителя колонизации и передачи. Кроме того использование РНК зондов, направленных против определенных бактериальных РНК позволяет обнаружение жизнеспособных бактерий в кишечнике клеща.

Protocol

1. Подготовка ДНК шаблонов Скачать 16S рРНК последовательности конкретных для каждого бактериальных родов от NCBI базы данных и дизайн полимеразной цепной реакции (ПЦР) совместимые вперед и обратить вспять грунты, которые усиливают родов конкретных регионах (~ 200-250-пары длинный), как о…

Representative Results

Измерение и оценка качества зонды RNA критических до начала окрашивания. В vitro транскрипция эффективность весьма зависит от количества и качества ДНК шаблона. Мы регулярно визуализирована РНК зонды на формальдегид гель для проверки чистоты и количество зонд, поро?…

Discussion

Это первое использование техники целом гора в situ гибридизация (WMISH) для изучения микробиоты членистоногих вектора патогенов. Наш протокол был адаптирован от одного используется для изучения развития дрозофилы и лягушка эмбрионов25,26. Целом гора…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы искренне благодарим д-р Мустафа Коха, Йельский университет, для обеспечения использования его ресурсов лаборатории. Мы благодарны г-н Ву Минг-Цзе за отличную техническую помощь. EF является следователь HHMI. Эта работа была поддержана в подарок от Джона Monsky и Дженнифер Вейс Monsky болезнь Лайма исследований фонда.

Materials

Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron Amazon 03-110/47
pGEM-T Easy Vector System Promega A1360
Digoxygenin-11-UTP Roche 1209256910
dNTP New England Biolabs  N0447S
DNAse I(RNAse-free) New England Biolabs M0303S
HiScribe SP6 RNA synthesis kit New England Biolabs E2070S
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England Biolabs E2040S
Water, RNase-free, DEPC-treated American Bioanalytical AB02128-00500
EDTA, 0.5M, pH 8.0 American Bioanalytical AB00502-01000
Formaldehyde, 37% JT Baker 2106-01
Formamide American Bioanalytical AB00600-00500
EGTA Sigma Aldrich E-4378
DPBS, 10X Gibco 14300-075
Tween-20 Sigma Aldrich P1379-25ML
Proteinase K Sigma Aldrich 3115879001
Triethanolamine HCl Sigma Aldrich T1502-100G
Acetic anhydride Sigma Aldrich 320102-100ML
Paraformaldehyde ThermoScientific/Pierce 28906
SSC, 20X American Bioanalytical AB13156-01000
RNA from torula yeast Sigma Aldrich R3629-5G
Heparin, sodium salt Sigma Aldrich H3393-10KU
Denhardt's Solution, 50X Sigma Aldrich D2532-5ML
CHAPS hydrate Sigma Aldrich C3023-1G
RNase A Sigma Aldrich 10109142001
RNase T1 ThermoScientific  EN0541
Maleic acid Sigma Aldrich M0375-100G
Blocking reagent Sigma Aldrich 11096176001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742-250MG
Chromogenic substrate for alkaline phosphatase Sigma Aldrich 11442074001
Bouin's solution Sigma Aldrich HT10132-1L
Hydrogen peroxide Mallinkrodt Baker, Inc 2186-01
Single stranded RNA ladder Ambion -Millenium AM7151
 #11 High-Carbon steel blades  C and A Scientific Premiere #11-9411
Thermocycler BioRad, CA 1851148
Spectrophotometer ThermoScientific  NanoDrop 2000C
Orbital shaker VWR DS-500E Digital Orbital shaker
Shaking water bath BELLCO Glass, Inc Hot Shaker-7746-12110
Gel  documentation system BioRad Gel Doc XR+ Gel documentation system
Bright-field Microscope  Nikon NikonSM2745T
Bright-field Microscope  Zeiss AXIO Scope.A1
Dissection microscope  Zeiss STEMI 2000-C
 Light box VWR 102097-658
PCR purification kit  Qiagen 28104
Image capture software Zeiss Zen lite
Image editing software  Adobe  Adobe Photoshop CS4 version 11.0
Image analysis software National Institutes of Health ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/
Automation compatible instrumentation Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).  Intavis, Biolane HT1.16v

References

  1. Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).
  2. Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
  3. Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
  4. Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
  5. Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
  6. Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).
  7. Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
  8. Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
  9. Grigor’eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
  10. Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
  12. Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
  13. Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
  14. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
  15. Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
  16. Sonenshine, D. E. . Biology of ticks. , (1991).
  17. Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
  18. Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
  19. Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
  20. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  21. Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
  22. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase–an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
  23. Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).
  24. Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
  25. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  26. Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).
  27. Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
  28. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
  29. Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
  30. Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
  31. Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057 (2013).

Play Video

Citer Cet Article
Moss, C. E., Robson, A., Fikrig, E., Narasimhan, S. Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (136), e57758, doi:10.3791/57758 (2018).

View Video