FM colorant cyclisme au niveau de la Synapse : en comparant la dépolarisation élevés de Potassium, électrique et Stimulation de la Channelrhodopsin
Summary
Les vésicules synaptiques (SV) le vélo est le mécanisme central de la communication intercellulaire au niveau des synapses neuronales. Libération et l’absorption de teinture de FM sont les principaux moyens de dosage quantitatif SV endo – et l’exocytose. Nous comparons ici, toutes les méthodes de stimulation pour conduire FM1-43 cyclisme synaptique jonction neuromusculaire (NMJ) modèle drosophile .
Abstract
FM colorants sont utilisés pour étudier le cycle de la vésicule synaptique (SV). Ces sondes amphipathic ont une tête hydrophile et une queue hydrophobe, ce qui les rend solubles dans l’eau avec la capacité de façon réversible, entrer et sortir des bicouches lipidiques membranaires. Ces colorants styryl sont relativement non fluorescent en milieu aqueux, mais l’insertion dans le feuillet externe de la membrane plasmique provoque un > 40 X augmentation de fluorescence. Dans les synapses neuronales, FM colorants sont intériorisées au cours de l’endocytose SV, victimes de la traite au sein et entre les bassins de la SV et libérée par exocytose SV, fournissant un outil puissant pour visualiser les étapes présynaptiques de la neurotransmission. Un modèle génétique primaire de développement synapse glutamatergique et la fonction est la drosophile jonction neuromusculaire (NMJ), où FM teindre imagerie a été largement utilisée pour quantifier la dynamique de la SV dans un large éventail de conditions mutants. Le terminal synaptique NMJ est facilement accessible, avec une belle palette de grands boutons synaptiques idéales pour les applications d’imagerie. Ici, nous comparer et contraster les trois façons de stimuler la drosophile NMJ pour piloter l’activité dépendante FM1-43 colorant capture/release : demande 1) bain de haut [K+] à dépolariser tissus neuromusculaires, 2) aspiration des nerfs moteurs électrode stimulation à dépolariser le nerveuses présynaptiques terminal et 3) cible expression transgénique des variantes de channelrhodopsin pour le contrôle spatial, stimulée par la lumière de la dépolarisation. Chacune de ces méthodes a des avantages et des inconvénients pour l’étude des effets de la mutation génétique sur le cycle de la SV à la drosophile NMJ. Nous allons discuter de ces avantages et les inconvénients pour aider la sélection de l’approche de la stimulation, ainsi que les méthodologies spécifiques à chacune de ces stratégies. En plus de l’imagerie de fluorescence, FM colorants peuvent être photoconverted aux signaux dense aux électrons visualisés à l’aide de microscopie électronique à transmission (TEM) pour étudier les mécanismes cycle SV au niveau ultrastructural. Nous fournissons les comparaisons de confocale et microscopie imagerie de différentes méthodes de stimulation NMJ Drosophila , pour aider à guider la sélection des futurs paradigmes expérimentaux.
Introduction
Le modèle de synapse et de glutamatergique caractérise magnifiquement Drosophila larvaire de la jonction neuromusculaire (NMJ) a été utilisé pour étudier la formation des synapses et la fonction avec un vaste éventail de perturbations génétiques1. Le terminal de neurones moteurs se compose de plusieurs branches axon, chacun avec plusieurs boutons synaptiques élargies. Ces varicosités de grande capacitées (jusqu’à 5 µm de diamètre) contiennent toute la machinerie de la neurotransmission, y compris les vésicules synaptiques glutamatergique uniforme (SVs ; ~ 40 nm de diamètre) dans la réserve cytosolique et piscines facilement libérable par2. Ces vésicules ancrer aux membrane présynaptique de plasma fusion site zones actives (AZs), où l’exocytose intervient dans la libération de neurotransmetteur glutamate pour trans-communication synaptique. Par la suite, le SVs sont extraites de la membrane plasmique par kiss-and-run de recyclage ou d’endocytose clathrine (CME) pour les cycles répétés d’exo/endocytose. La drosophile NMJ est facilement accessible et bien adapté pour les isoler et caractériser des mutants de cycle SV. À l’aide d’écrans génétiques avant, nouvelles mutations ont conduit à l’identification de nouveaux gènes critiques pour le SV cycle3. En outre, les approches génétiques inverses à partir de gènes déjà connus ont conduit à l’élucidation des mécanismes de cycle SV nouvelles par le biais de la description minutieuse du mutant cyclisme phénotypes4. La drosophile NMJ est presque idéales comme préparation pour disséquer les mécanismes de l’endocytose et l’exocytose SV grâce à des méthodes à optiquement piste vésicule cyclisme au cours de la neurotransmission synaptique expérimentale.
Une gamme de marqueurs fluorescents permettent suivi visuel des vésicules au cours de cyclisme dynamique, mais les plus polyvalents sont des analogues de colorant de FM qui est synthétisé pour la première fois par Mao, F., et al. 5. structurellement, FM colorants contiennent une tête hydrophile et une queue lipophile connectés grâce à un cycle aromatique, avec une région centrale conférant des propriétés spectrales. Ces styryl colorants partitionner de manière réversible dans les membranes, ne pas « bascule » entre les feuillets de la membrane et ne sont donc jamais libre dans le cytosol et sont beaucoup plus fluorescentes dans les membranes à l’eau5. Réversible insertion dans une bicouche lipidique provoque une augmentation de 40 fois en fluorescence6. Au niveau des synapses neuronales, classic FM colorant étiquetage des expériences consistent en la préparation synaptique avec le colorant au cours de la stimulation de dépolarisation pour charger le colorant par endocytose SV de baignade. Teinture extérieure est alors emporté et le cycle de la SV est arrêté dans une solution de ringer sans calcium afin d’imager les synapses chargé7. Une deuxième série de stimulation dans un bain sans colorant déclenche FM libération par exocytose, un processus qui peut être suivi en mesurant la diminution d’intensité de fluorescence. Les populations de SV d’une vésicule simple aux piscines contenant des centaines de vésicules peuvent être quantitativement surveillé6,7. Colorants de FM ont été utilisés pour disséquer la mobilisation activité dépendante des pools SV fonctionnellement distincts et de comparer les kiss-and-run vs CME cyclisme8,9. La méthode a été modifiée pour dosage séparément évoquée, spontanée et miniature cycle synaptique activités (avec équipement très sensible pour détecter des changements très faible fluorescence et réduire photobleaching)10. Dosages peuvent être étendues au niveau ultrastructural de photoconverting le signal FM fluorescent à une étiquette opaques pour transmission electron microscopy11,12,13,14 .
Historiquement, les préparations synaptique se baigner dans une forte concentration de potassium (ci-après dénommé « high [K+] ») est la méthode de choix pour dépolariser la stimulation pour provoquer le SV cyclisme ; allant de la grenouille cholinergique NMJ5, à cultivé des neurones de l’hippocampe cerveau rongeurs15, à la drosophile glutamatergique NMJ modèle16,17. Cette approche [K+] élevée est simple, ne besoin d’aucun équipement spécialisé et est donc accessible à la plupart des laboratoires, mais a des limites pour les application et interprétation des données. Une méthode beaucoup plus physiologiquement appropriée consiste à utiliser l’électrode d’aspiration la stimulation électrique du nerf4,5,12. Cette approche conduit la propagation du potentiel d’action pour la stimulation directe du nerf présynaptique terminal, et les résultats peuvent être comparés directement à des tests électrophysiologiques de neurotransmission fonction13,14, 15, mais besoin d’équipement spécialisé et est techniquement beaucoup plus difficile. Avec l’avènement d’optogenetics, l’utilisation de la stimulation neuronale channelrhodopsin a des avantages supplémentaires, y compris un contrôle strict spatio-temporelle de l’expression des canaux en utilisant le binaire de système de Gal4/UAS20. Cette approche est techniquement beaucoup plus facile que la stimulation de l’électrode d’aspiration et n’exige rien de plus qu’une source de lumière LED très bon marchée. Ici, nous utilisons l’imagerie de FM1-43 (dibromure de pyridiniumN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl)) pour les comparer et contraster ces trois méthodes différentes de stimulation à la drosophile NMJ : haute simple [K+ ], contestant les channelrhodopsin électriques et nouvelles approches.
Protocol
Representative Results
Discussion
Haute [K+] la stimulation dépolarisante saline est de loin le plus facile des trois options pour la teinture de FM activité-dépendant du cyclisme, mais probablement la moins physiologique29. Cette méthode simple dépolarise chaque cellule accessible chez l’animal entier et donc ne permet pas aux études dirigées. Il peut être possible d’appliquer localement élevés [K+] une solution saline avec une micropipette, mais cela sera toujours dépolariser les cellules pr?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres Broadie Lab pour contribution à cet article. Ce travail a été soutenu par les NIH R01s MH096832 et MH084989 à K.B. et NIH pré-doctoral fellowship F31 MH111144 à D.L.K.
Materials
| SylGard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | To put on cover glass for dissections |
| Microscope Cover Glass 22×22-1 | Fisherbrand | 12-542-B | To put SylGard on for dissections |
| Aluminum Top Hot Plate Type 2200 | Thermolyne | HPA2235M | To cure the SylGard |
| Plexi glass dissection chamber | N/A | N/A | Handmade |
| Borosilicate Glass Capillaries | WPI | 1B100F-4 | To make suction and glue micropipettes |
| Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-2000 | To make suction and glue micropipettes |
| Tygon E-3603 Laboratory Tubing | Component Supply Co. | TET-031A | For mouth and suction pipette |
| P2 pipette tip | USA Scientific | 1111-3700 | For mouth pipette |
| 0.6-mL Eppendorf tube cap | Fisher Scientific | 05-408-120 | Used to put glue in for dissection |
| Vetbond 3M | WPI | vetbond | Glue used for dissections |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P-217 | Forsaline |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S5886 | For saline |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M35-500 | For saline |
| Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | For saline |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | For saline |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | For saline |
| HRP:Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 123-605-021 | To label neuronal membranes |
| Paintbrush | Winsor & Newton | 94376864793 | To manipulate the larvae |
| Dumont Dumostar Tweezers #5 | WPI | 500233 | Used during dissection |
| 7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) | WPI | 14177 | Used during dissection |
| FM1-43 | Fisher Scientific | T35356 | Fluorescent styryl dye |
| Digital Timer | VWR | 62344-641 | For timing FM dye load/unload |
| LSM 510 META laser-scanning confocal microscope | Zeiss | For imaging the fluorescent markers | |
| Zen 2009 SP2 version 6.0 | Zeiss | Software for imaging on confocal | |
| HeNe 633nm laser | Lasos | To excite HRP:647 during imaging | |
| Argon 488nm laser | Lasos | To excite the FM dye during imaging | |
| Micro-Forge | WPI | MF200 | To fire polish glass micropipettes |
| 20mL Syringe Slip Tip | BD | 301625 | To suck up the axon for electrical stimulation. |
| Micro Manipulator (magnetic base) | Narishige | MMN-9 | To control the suction electrode for electrical stimulation |
| Stimulator | Grass | S48 | To control the LED and electrical stimulation |
| Zeiss Axioskop Microscope | Zeiss | Used during electrical stimulation. | |
| 40X Achroplan Water Immersion Objective | Zeiss | Used during electrical stimulation and confocal imaging | |
| All-trans Retinal | Millipore Sigma | R2500 | Essential co-factor for ChR2 |
| Zeiss Stemi Microscope with camera port | Zeiss | 2000-C | Used during channelrhodopsin stimulation |
| LED 470nm | ThorLabs | M470L2 | Used for ChR activation |
| T-Cube LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | To control the LED |
| LED Power Supply | Cincon Electronics Co. | TR15RA150 | To power the LED |
| Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | To measure LED intensity |
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