FM colorant cyclisme au niveau de la Synapse : en comparant la dépolarisation élevés de Potassium, électrique et Stimulation de la Channelrhodopsin

Danielle L. Kopke; Kendal Broadie

doi:10.3791/57765

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Article de méthode

FM colorant cyclisme au niveau de la Synapse : en comparant la dépolarisation élevés de Potassium, électrique et Stimulation de la Channelrhodopsin

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DOI :

10.3791/57765

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24 mai 2018

Danielle L. Kopke¹ , Kendal Broadie²

¹Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, ²Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

Dans cet article

Résumé

Les vésicules synaptiques (SV) le vélo est le mécanisme central de la communication intercellulaire au niveau des synapses neuronales. Libération et l’absorption de teinture de FM sont les principaux moyens de dosage quantitatif SV endo - et l’exocytose. Nous comparons ici, toutes les méthodes de stimulation pour conduire FM1-43 cyclisme synaptique jonction neuromusculaire (NMJ) modèle drosophile .

Résumé

FM colorants sont utilisés pour étudier le cycle de la vésicule synaptique (SV). Ces sondes amphipathic ont une tête hydrophile et une queue hydrophobe, ce qui les rend solubles dans l’eau avec la capacité de façon réversible, entrer et sortir des bicouches lipidiques membranaires. Ces colorants styryl sont relativement non fluorescent en milieu aqueux, mais l’insertion dans le feuillet externe de la membrane plasmique provoque un > 40 X augmentation de fluorescence. Dans les synapses neuronales, FM colorants sont intériorisées au cours de l’endocytose SV, victimes de la traite au sein et entre les bassins de la SV et libérée par exocytose SV, fournissant un outil puissant pour visualiser les étapes présynaptiques de la neurotransmission. Un modèle génétique primaire de développement synapse glutamatergique et la fonction est la drosophile jonction neuromusculaire (NMJ), où FM teindre imagerie a été largement utilisée pour quantifier la dynamique de la SV dans un large éventail de conditions mutants. Le terminal synaptique NMJ est facilement accessible, avec une belle palette de grands boutons synaptiques idéales pour les applications d’imagerie. Ici, nous comparer et contraster les trois façons de stimuler la drosophile NMJ pour piloter l’activité dépendante FM1-43 colorant capture/release : demande 1) bain de haut [K⁺] à dépolariser tissus neuromusculaires, 2) aspiration des nerfs moteurs électrode stimulation à dépolariser le nerveuses présynaptiques terminal et 3) cible expression transgénique des variantes de channelrhodopsin pour le contrôle spatial, stimulée par la lumière de la dépolarisation. Chacune de ces méthodes a des avantages et des inconvénients pour l’étude des effets de la mutation génétique sur le cycle de la SV à la drosophile NMJ. Nous allons discuter de ces avantages et les inconvénients pour aider la sélection de l’approche de la stimulation, ainsi que les méthodologies spécifiques à chacune de ces stratégies. En plus de l’imagerie de fluorescence, FM colorants peuvent être photoconverted aux signaux dense aux électrons visualisés à l’aide de microscopie électronique à transmission (TEM) pour étudier les mécanismes cycle SV au niveau ultrastructural. Nous fournissons les comparaisons de confocale et microscopie imagerie de différentes méthodes de stimulation NMJ Drosophila , pour aider à guider la sélection des futurs paradigmes expérimentaux.

Introduction

Le modèle de synapse et de glutamatergique caractérise magnifiquement Drosophila larvaire de la jonction neuromusculaire (NMJ) a été utilisé pour étudier la formation des synapses et la fonction avec un vaste éventail de perturbations génétiques¹. Le terminal de neurones moteurs se compose de plusieurs branches axon, chacun avec plusieurs boutons synaptiques élargies. Ces varicosités de grande capacitées (jusqu'à 5 µm de diamètre) contiennent toute la machinerie de la neurotransmission, y compris les vésicules synaptiques glutamatergique uniforme (SVs ; ~ 40 nm de diamètre) dans la réserve cytosolique et piscines facilement libérable p....