Synapse में एफएम डाई सायक्लिंग: उच्च पोटेशियम ध्रुवीकरण, बिजली और Channelrhodopsin उत्तेजना की तुलना
Summary
Synaptic पुटिका (एसवी) सायक्लिंग, न्यूरॉन synapses में सेलुलर संचार का मुख्य तंत्र है । एफएम डाई और रिलीज के लिए मात्रात्मक परख एसवी इंडो-और exocytosis के प्राथमिक साधन हैं । यहां, हम सभी उत्तेजना तरीकों की तुलना करने के लिए FM1-43 साइकिल चालन के लिए Drosophila neuromuscular जंक्शन (NMJ) मॉडल synapse ।
Abstract
एफएम रंजक synaptic पुटिका (एसवी) चक्र का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है । ये amphipathic जांच एक हाइड्रोफिलिक सिर और hydrophobic पूंछ है, उंहें पानी में घुलनशील बनाने के लिए reversibly प्रवेश और निकास झिल्ली लिपिड bilayers की क्षमता के साथ । इन styryl रंजक अपेक्षाकृत गैर जलीय मध्यम में फ्लोरोसेंट हैं, लेकिन प्लाज्मा झिल्ली के बाहरी पत्रक में प्रविष्टि का कारण बनता है एक > 40X प्रतिदीप्ति में वृद्धि हुई है । synapses में, एफएम रंजक एसवी endocytosis के दौरान आंतरिक, दोनों भीतर और एसवी पूल के बीच, और एसवी exocytosis के साथ जारी, neurotransmission के presynaptic चरणों कल्पना करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान कर रहे हैं । glutamatergic synapse विकास और समारोह के एक प्राथमिक आनुवंशिक मॉडल Drosophila neuromuscular जंक्शन (NMJ) है, जहां एफएम डाई इमेजिंग उत्परिवर्ती शर्तों की एक विस्तृत श्रृंखला में एसवी गतिशीलता यों तो बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है । NMJ synaptic टर्मिनल आसानी से सुलभ है, इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए बड़े synaptic बूटोंस आदर्श की एक सुंदर सरणी के साथ । यहां, हम तुलना और इसके विपरीत तीन तरीके को उत्तेजित करने के लिए Drosophila NMJ गतिविधि पर निर्भर FM1-43 डाई तेज/रिलीज: 1) स्नान आवेदन उच्च [K+] neuromuscular ऊतकों का ध्रुवीकरण करने के लिए, 2) सक्शन इलेक्ट्रोड मोटर तंत्रिका उत्तेजना presynaptic तंत्रिका टर्मिनल का ध्रुवीकरण करने के लिए, और 3) प्रकाश के लिए channelrhodopsin वेरिएंट के लक्षित ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति-उत्तेजित, ध्रुवीकरण के स्थानिक नियंत्रण । इन तरीकों में से प्रत्येक के Drosophila NMJ पर एसवी चक्र पर आनुवंशिक उत्परिवर्तन प्रभाव के अध्ययन के लिए लाभ और नुकसान है । हम इन फायदों और नुकसान पर चर्चा के लिए उत्तेजना दृष्टिकोण के चयन की सहायता, एक साथ एक रणनीति के लिए विशिष्ट तरीके के साथ होगा । फ्लोरोसेंट इमेजिंग के अलावा, एफएम रंजक एक ultrastructural स्तर पर एसवी चक्र तंत्र का अध्ययन करने के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) का उपयोग कर visualized इलेक्ट्रॉन घने संकेतों को photoconverted जा सकता है । हम Drosophila NMJ उत्तेजना के विभिंन तरीकों से फोकल और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग की तुलना प्रदान करते हैं, के लिए भविष्य के प्रायोगिक मानदंड के चयन गाइड मदद करते हैं ।
Introduction
खूबसूरती के पात्र Drosophila लार्वा neuromuscular जंक्शन (NMJ) glutamatergic synapse मॉडल आनुवंशिक synapse1के एक विशाल स्पेक्ट्रम के साथ perturbations गठन और समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । मोटर न्यूरॉन टर्मिनल कई axon शाखाओं के होते हैं, प्रत्येक के साथ अनेक बढ़े हुए synaptic बूटोंस. इन विशाल varicosities (व्यास में 5 µm) glutamatergic रिजर्व में वर्दी synaptic SVs बुलबुले (cytosolic; ~ ४० एनएम व्यास में) सहित neurotransmission मशीनरी के सभी होते हैं, और आसानी से पट्टे पर देने वाली पूल2। presynaptic प्लाज्मा झिल्ली फ्यूजन साइट सक्रिय क्षेत्र (AZs), जहां exocytosis ट्रांस-synaptic संचार के लिए ग्लूटामेट न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई मध्यस्थता में ये बुलबुले गोदी । बाद में, SVs चुंबन के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली से प्राप्त कर रहे है और रिसाइकिलिंग चलाने या clathrin-दोहराया exo के लिए मध्यस्थता endocytosis (सीएमई)/endocytosis चक्र । Drosophila NMJ आसानी से सुलभ और दोनों अलग और निस्र्पक एसवी चक्र म्यूटेंट के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है । आगे आनुवंशिक स्क्रीन का प्रयोग, उपंयास उत्परिवर्तनों नए एसवी चक्र के लिए महत्वपूर्ण जीन की पहचान के लिए नेतृत्व किया है3। इसके अलावा, रिवर्स आनुवंशिक पहले से ही ज्ञात जीन के साथ शुरू दृष्टिकोण उत्परिवर्ती सायक्लिंग phenotypes के सावधान विवरण के माध्यम से नई एसवी चक्र तंत्र के elucidation के लिए नेतृत्व किया है4। Drosophila NMJ लगभग exocytosis के दौरान पुटिका साइकिल चालन के लिए ऑप्टिकली ट्रैक करने के तरीकों के माध्यम से एसवी endocytosis और neurotransmission तंत्र के लिए एक प्रयोगात्मक synaptic तैयारी के रूप में आदर्श है ।
फ्लोरोसेंट मार्करों की एक सीमा साइकिल गतिशीलता के दौरान बुलबुले के दृश्य ट्रैकिंग की अनुमति है, लेकिन सबसे बहुमुखी एफएम डाई अनुरूप है जो पहले माओ, एफ., एट अलद्वारा संश्लेषित किया जाता है । 5. संरचनात्मक रूप से, एफएम रंजक एक हाइड्रोफिलिक सिर और एक lipophilic पूंछ एक खुशबूदार अंगूठी के माध्यम से जुड़े होते हैं, एक केंद्रीय वर्णक्रमीय गुण प्रदान क्षेत्र के साथ । झिल्ली में इन styryl रंजक विभाजन reversibly, झिल्ली पत्रक के बीच ‘ फ्लिप फ्लॉप ‘ नहीं है और इसलिए cytosol में मुक्त नहीं कर रहे हैं, और पानी की तुलना में झिल्ली में कहीं अधिक फ्लोरोसेंट हैं5. एक लिपिड bilayer में प्रतिवर्ती प्रविष्टि प्रतिदीप्ति6में ४० गुना वृद्धि का कारण बनता है । न्यूरॉन synapses पर, क्लासिक एफएम डाई लेबलिंग प्रयोगों से मिलकर स्नान synaptic तैयारी के दौरान डाई के साथ ध्रुवीकरण उत्तेजना करने के लिए लोड डाई के माध्यम से एसवी endocytosis. बाहरी डाई तो दूर धोया जाता है और एसवी चक्र7synapses भरी हुई छवि के लिए एक कैल्शियम से मुक्त घंटी समाधान में गिरफ्तार कर लिया है । एक डाई मुक्त स्नान में उत्तेजना के एक दूसरे दौर exocytosis, एक प्रक्रिया है कि प्रतिदीप्ति तीव्रता कमी को मापने के बाद किया जा सकता है के माध्यम से एफएम रिलीज चलाता है । एसवी एक एकल पुटिका से आबादी के लिए बुलबुले के सैकड़ों युक्त पूल मात्रात्मक6,7पर नजर रखी जा सकता है । एफएम रंजक कार्यात्मक अलग एसवी पूल के काटना गतिविधि पर निर्भर जमावड़े के लिए इस्तेमाल किया गया है, और चुंबन की तुलना करने के लिए और रन बनाम सीएमई सायक्लिंग8,9। विधि अलग परख, सहज और लघु synaptic चक्र गतिविधियों को संशोधित किया गया है (अति संवेदनशील उपकरणों के साथ बहुत छोटे प्रतिदीप्ति परिवर्तन का पता लगाने और photobleaching कम)10। परख एक इलेक्ट्रॉन में फ्लोरोसेंट एफएम संकेत photoconverting द्वारा ultrastructural स्तर तक बढ़ाया जा सकता है-संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए घने लेबल11,12,13,14 .
पोटेशियम की एक उच्च एकाग्रता में ऐतिहासिक, स्नान synaptic तैयारी (इसके बाद के रूप में “उच्च [कश्मीर) के लिए भेजा]”) के लिए पसंद की विधि के लिए किया गया है को भंग उत्तेजना के लिए प्रेरित एसवी साइकिल चालन; को लेकर मेंढक कोलीनर्जिक NMJ5, को कल्चरल कुतर मस् हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स15, को Drosophila glutamatergic NMJ मॉडल16,17. यह उच्च [K+] दृष्टिकोण सरल है, कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, और इसलिए सबसे प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ है, लेकिन दोनों आवेदन और डेटा की व्याख्या के लिए सीमाएं हैं । एक बहुत अधिक शारीरिक रूप से उचित तरीका है चूषण4,5,12की बिजली की उत्तेजना सक्शन इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए है । इस दृष्टिकोण presynaptic तंत्रिका टर्मिनल के प्रत्यक्ष उत्तेजना के लिए कार्रवाई संभावित प्रचार ड्राइव, और परिणाम सीधे neurotransmission समारोह के electrophysiological परख की तुलना में किया जा सकता है13,14, 15, लेकिन विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और तकनीकी रूप से बहुत अधिक चुनौतीपूर्ण है । optogenetics के आगमन के साथ, channelrhodopsin न्यूरॉन उत्तेजना का उपयोग अतिरिक्त लाभ, चैनल अभिव्यक्ति के तंग spatiotemporal नियंत्रण बाइनरी Gal4/यूएएस प्रणाली20का उपयोग सहित है । इस दृष्टिकोण तकनीकी रूप से बहुत सक्शन इलेक्ट्रोड उत्तेजना से आसान है और एक बहुत सस्ते एलईडी प्रकाश स्रोत से अधिक कुछ नहीं की आवश्यकता है । यहां, हम FM1 की इमेजिंग-43 रोजगार (N-(3 triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino) styryl) pyridinium dibromide) दोनों की तुलना करने के लिए और इसके विपरीत इन तीन अलग उत्तेजना तरीकों पर Drosophila NMJ: सरल उच्च [K+ ], इलेक्ट्रिकल और नए channelrhodopsin दृष्टिकोणों को चुनौती ।
Protocol
Representative Results
Discussion
उच्च [K+] खारा ध्रुवीकरण उत्तेजना अब तक गतिविधि पर निर्भर एफएम डाई साइकिल चालन के लिए तीन विकल्पों में से सबसे आसान है, लेकिन संभावना कम शारीरिक29। इस सरल विधि पूरे जानवर में हर सुलभ सेल का ध्र…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस लेख के लिए योगदान के लिए Broadie प्रयोगशाला के सदस्यों को धंयवाद । इस काम को NIH R01s MH096832 और MH084989 को K.B., और NIH डॉक्टरेट फेलोशिप F31 MH111144 को D.L.K. से समर्थन मिला
Materials
| SylGard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | To put on cover glass for dissections |
| Microscope Cover Glass 22×22-1 | Fisherbrand | 12-542-B | To put SylGard on for dissections |
| Aluminum Top Hot Plate Type 2200 | Thermolyne | HPA2235M | To cure the SylGard |
| Plexi glass dissection chamber | N/A | N/A | Handmade |
| Borosilicate Glass Capillaries | WPI | 1B100F-4 | To make suction and glue micropipettes |
| Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-2000 | To make suction and glue micropipettes |
| Tygon E-3603 Laboratory Tubing | Component Supply Co. | TET-031A | For mouth and suction pipette |
| P2 pipette tip | USA Scientific | 1111-3700 | For mouth pipette |
| 0.6-mL Eppendorf tube cap | Fisher Scientific | 05-408-120 | Used to put glue in for dissection |
| Vetbond 3M | WPI | vetbond | Glue used for dissections |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P-217 | Forsaline |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S5886 | For saline |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M35-500 | For saline |
| Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | For saline |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | For saline |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | For saline |
| HRP:Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 123-605-021 | To label neuronal membranes |
| Paintbrush | Winsor & Newton | 94376864793 | To manipulate the larvae |
| Dumont Dumostar Tweezers #5 | WPI | 500233 | Used during dissection |
| 7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) | WPI | 14177 | Used during dissection |
| FM1-43 | Fisher Scientific | T35356 | Fluorescent styryl dye |
| Digital Timer | VWR | 62344-641 | For timing FM dye load/unload |
| LSM 510 META laser-scanning confocal microscope | Zeiss | For imaging the fluorescent markers | |
| Zen 2009 SP2 version 6.0 | Zeiss | Software for imaging on confocal | |
| HeNe 633nm laser | Lasos | To excite HRP:647 during imaging | |
| Argon 488nm laser | Lasos | To excite the FM dye during imaging | |
| Micro-Forge | WPI | MF200 | To fire polish glass micropipettes |
| 20mL Syringe Slip Tip | BD | 301625 | To suck up the axon for electrical stimulation. |
| Micro Manipulator (magnetic base) | Narishige | MMN-9 | To control the suction electrode for electrical stimulation |
| Stimulator | Grass | S48 | To control the LED and electrical stimulation |
| Zeiss Axioskop Microscope | Zeiss | Used during electrical stimulation. | |
| 40X Achroplan Water Immersion Objective | Zeiss | Used during electrical stimulation and confocal imaging | |
| All-trans Retinal | Millipore Sigma | R2500 | Essential co-factor for ChR2 |
| Zeiss Stemi Microscope with camera port | Zeiss | 2000-C | Used during channelrhodopsin stimulation |
| LED 470nm | ThorLabs | M470L2 | Used for ChR activation |
| T-Cube LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | To control the LED |
| LED Power Supply | Cincon Electronics Co. | TR15RA150 | To power the LED |
| Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | To measure LED intensity |
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